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Jun 12, 2023

Hidrogel adhesivo a base de gelatina bioinspirado para diversas superficies en el cuidado de heridas por quemaduras

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 13735 (2022) Cite este artículo 4694 Accesos 4 Citas Detalles de métricas El tratamiento adecuado de las quemaduras considera el cumplimiento del paciente y proporciona una

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 13735 (2022) Citar este artículo

4694 Accesos

4 citas

Detalles de métricas

El tratamiento adecuado de las quemaduras considera el cumplimiento del paciente y proporciona un entorno para acelerar el cierre de la herida. Los hidrogeles pegajosos favorecen el tratamiento de heridas. Pueden actuar como un parche preventivo de infección con administración controlada de fármacos y adherencia a diversas superficies. Una investigación basada en hipótesis explora una propiedad de polidopamina bioinspirada en un hidrogel a base de gelatina (GbH) donde el alcohol polivinílico y el almidón funcionan como columna vertebral del hidrogel. El GbH mostró propiedades físicas prometedoras con una superficie rica en grupos O – H. El GbH era pegajoso sobre superficies secas (vidrio, plástico y aluminio) y húmedas (cerdo y pollo). El GbH demostró una cinética matemática para una formulación transdérmica, y la toxicidad in vitro e in vivo del GbH en modelos de prueba confirmó el crecimiento saludable y la biocompatibilidad de los modelos. La GbH cargada con quercetina mostró una contracción de la herida de 45 a 50% el día 4 para quemaduras de segundo grado en modelos de ratas que eran equivalentes al grupo de tratamiento con sulfadiazina de plata. Las estimaciones de resistencia a la tracción, bioquímicos, marcadores de tejido conectivo y NF-κB se restauraron el día 21 en las heridas cicatrizadas tratadas con GbH para imitar el nivel normal de la piel. El GbH bioinspirado promueve la curación eficiente de quemaduras de segundo grado en modelos de ratas, lo que indica su aplicabilidad preclínica.

La búsqueda de la humanidad de inspiración en la naturaleza ha llevado a la creación exitosa de hidrogeles novedosos y funcionales1. La biomimética del moco protector a base de babosas contribuyó al desarrollo de hidrogeles resistentes y adherentes a la superficie de una combinación de alginato y poliacrilamida2,3. Recientemente se ha desarrollado un complejo de dopamina eficaz en el diseño de hidrogel adhesivo de superficie, inspirado en animales acuáticos, como los mejillones, donde la dopamina actúa como ingrediente principal para la adhesión bajo el agua4. Se han diseñado muchos hidrogeles bioinspirados utilizando el biosistema como modelo para comprender sus diversas funciones, desde su arquitectura molecular hasta su geometría macroscópica5. Los hidrogeles son redes tridimensionales complejas (3-D) de cadenas de polímeros hidrófilos y, dada su naturaleza hidrófila, contienen cantidades significativas de agua6,7. Presentan hinchazón cuando se exponen al agua, especialmente porque el cuerpo humano tiene agua como componente principal y los hidrogeles pueden contener grandes volúmenes de agua. Por lo tanto, les permite ser un excelente candidato para diversos usos biomédicos, como ingeniería de tejidos, administración de fármacos, materiales de autocuración, biosensores y vendajes hemostáticos8,9.

El órgano más grande y esencial de nuestro cuerpo, la piel, es una capa defensiva exterior. Los materiales clásicos para apósitos para heridas, como los tejidos secos (gasa absorbente o algodón), tienen beneficios medicinales mínimos, implican dolor y requieren ajustes frecuentes en el apósito, lo que provoca malestar continuo en el paciente. Los hidrogeles son prometedores ya que promueven la curación al mantener un nivel de humedad adecuado en el lugar de la herida. La mayoría de los estudios sobre el cuidado de heridas consideran que los hidrogeles son los mejores candidatos para los apósitos, ya que tienen una estructura tridimensional que se asemeja a la matriz extracelular natural, lo que garantiza a la herida una atmósfera húmeda10,11. Las fracturas epiteliales y los sistemas conectivos sustentan la capacidad del cuerpo humano para garantizar una protección suficiente contra daños externos12. La piel parece ser el más vulnerable de todos los órganos del cuerpo humano, desde hematomas y rasguños hasta quemaduras. Estadísticamente, las quemaduras son la cuarta forma de traumatismo debilitante más frecuente13. Se espera que un apósito ideal para quemaduras promueva la recuperación en períodos más cortos y alivie el dolor, ya que las quemaduras requieren atención médica prolongada.

En la última década, la química de catecol inspirada en el mejillón se ha convertido en una parte intrigante de la ciencia, especialmente en los hidrogeles14, donde las composiciones de poliacrilamida y bisacrilamida son una matriz común para un sistema de hidrogel atrapado en catecol15. Las investigaciones indican que el contacto prolongado o frecuente de la poliacrilamida y la bisacrilamida con la piel puede desencadenar dermatitis y cáncer en modelos animales16. Los hallazgos preclínicos sugieren que la exposición continua a composiciones de poliacrilamida y bisacrilamida en estudios de modelos animales comprometió los sistemas reproductivo y nervioso17. Aunque hay múltiples apósitos disponibles en el mercado, se debe establecer una solución innovadora para el tratamiento de heridas para tratar las quemaduras. La investigación actual se basa en la hipótesis de que "la polidopamina exhibe una propiedad adhesiva en una composición no tóxica de formulación de hidrogel". Por lo tanto, se desarrolló el apósito para heridas GbH y se evaluó su desempeño físico y biológico en diversas superficies. Finalmente, se evaluó el patrón de liberación del fármaco del parche de hidrogel del apósito para heridas para comprender el patrón de difusión del fármaco de la formulación en la cicatrización de heridas de quemaduras parciales de segundo grado en modelos de ratas.

La optimización clásica adoptada en la presente investigación ha llevado al desarrollo de GbH con la propiedad pegajosa de una polidomina bioinspirada2,18. Los hidrogeles de PVA tienen numerosas aplicaciones en la industria farmacéutica y biomédica debido a su facilidad de procesamiento, biocompatibilidad, no carcinogenicidad, bioadhesividad, no toxicidad y transparencia. La mezcla de hidrogeles sintéticos como PVA, policaprolactona y ácido poliláctico con almidón asegura la abundancia de grupos hidroxilo y mejora las propiedades mecánicas19,20,21. El almidón, un biopolímero abundantemente disponible en la naturaleza, es rentable, está ampliamente disponible con propiedades termoplásticas y eficientemente biodegradables. Sin embargo, un sistema a base de almidón frecuentemente presenta malas propiedades mecánicas, quebradizas y altamente solubles en agua, y una modificación con polímero sintético resulta ventajosa21,22. En el estudio actual, la mezcla de hidrogel de almidón y PVA, reticulada químicamente por reactivo de glutaraldehído (GA) (Fig. 1a) obtenida del proceso de fundición en solución, era transparente y no tenía propiedades adhesivas ni pegajosas. La mezcla de hidrogel de PVA-almidón sirvió como base para agregar una propiedad pegajosa. Se agregaron varias concentraciones de polidopamina a la base de hidrogel y luego se realizó la prueba de elongación (Tablas 1 y 2). Se encontró que la concentración más baja del 0,5% era elástica y apropiadamente pegajosa (Fig. 1a.1), como se desea en una formulación de hidrogel, ya que un apósito para heridas debe resistir cualquier fuerza externa y proteger la herida.

Rendimiento esquemático y diverso de GbH: (a) Esquema del hidrogel a base de gelatina (GbH) de superficie diversa desarrollado; (a.1) El GbH desarrollado es un proceso de dos etapas en el que los polímeros de alcohol polivinílico (PVA) y almidón, y la concentración optimizada de polidopamina polimerizada con álcali se reticula químicamente con el reactivo de glutaraldehído (GA), que actúa como gel base; (a.2) El exceso de glutaraldehído en la etapa semipolimerizada se reticula con gelatina y forma una red polimérica sobre el gel base. La red de gelatina previene el oxígeno externo e inhibe la oxidación de los grupos catecol.; Se utilizó la prueba de Benedict para determinar el exceso de glutaraldehído compuesto por: (b) PBS, (b.1) Tris-HCl, (b.2) AlCl2 y (b.3) agua destilada. El GbH desarrollado con estabilizador en diversas superficies: (c) pollo; (c.1) carne de cerdo; (c.2) superficie de acero inoxidable; (c.3) superficie de vidrio y (c.4) superficie de plástico.

La incorporación de gelatina y metaperiodato de sodio en estado semipolimerizado aseguró la propiedad pegajosa deseada, que persistió durante cuatro días a temperatura ambiente (temperatura ambiente, 22 ± 3 °C). La mejor combinación se observó con 500 μL de gelatina con una proporción de 1:5 de polidopamina y metaperiodato de sodio. Investigaciones anteriores sobre hidrogel de polidopamina-poliacrilamida inspirado en mejillones mantuvieron suficientes grupos catecol libres en el hidrogel y evitaron la sobreoxidación de la polidopamina4. La poliacrilamida en el hidrogel inspirado en el mejillón obstruyó el oxígeno externo e inhibió la oxidación de los grupos catecol formando una red polimérica. Los mejillones, en la naturaleza, previenen la sobreoxidación del grupo catecol al secretar proteínas reductoras ricas en cisteína, manteniendo así una fuerte adhesividad4. En la investigación actual, la red de gelatina evitó la sobreoxidación y dificultó la oxidación inmediata del grupo catecol, proporcionando así una propiedad pegajosa prolongada al catecol del hidrogel. El gel base está formado por la cadena reticulada de almidón de PVA (Fig. 1a.2). El agente reticulante GA reacciona con los grupos O-H adyacentes del PVA, formando glioxal cíclico23. La misma reticulación ocurre entre el almidón y el PVA. Las fuertes interacciones de enlaces H entre el almidón PVA también ayudaron a la formación de la red. La polidopamina también interactúa con el gel base formando enlaces de hidrógeno con el N – H presente en los grupos estructurales. El exceso de GA reticula la gelatina y estabiliza la red24. Los restos catecol de la polidopamina pueden sufrir diversas interacciones superficiales en el tejido normal, lo que da como resultado la formación de enlaces covalentes interfaciales25.

El GbH se sometió a un proceso de lavado para eliminar el exceso de GA. Por lo tanto, la prueba de Benedict26 determinó un tampón adecuado para promover la eliminación de un exceso del grupo funcional C – H – O. El cambio de color de verde oscuro a azul cristal en la prueba de Benedict es indicativo de la eliminación del grupo C – H – O. Los tampones utilizados fueron Tris-HCl (3 M), cloruro de aluminio (AlCl2) (50 mM), solución salina tamponada con fosfato (PBS) (0,1 M) y agua destilada (Fig. 1b-b.3). La prueba de Benedict reveló que el PBS es ideal para fines de lavado (Fig. 1b), donde el lavado se realizó en tres ciclos de 6 h, luego se descartó el tampón y el gel se rellenó con PBS nuevo para fines de conservación del gel, que se puede almacenar. a 4 °C en PBS o agua destilada. Los espectros de espectroscopía infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR) del gel lavado también respaldan la eliminación completa de GA; Los detalles de IR se explican brevemente en la sección "Caracterización de GbH". La pegajosidad del GbH a la superficie húmeda es posible gracias a los grupos amina de la superficie presentes en el hidrogel27,28. El GbH se mantuvo en diversas superficies (durante la noche a temperatura ambiente) y se observó la adherencia de cada hidrogel a la superficie (Fig. 1c-c.4). El GbH se colocó sobre diferentes superficies húmedas, como pollo (Fig. 1c) y cerdo (Fig. 1c.1) y superficies secas, como acero inoxidable (Fig. 1c.2), vidrio (Fig. 1c.3). y plástico (Fig. 1c.4). La pegajosidad del metal, el vidrio y la carne de cerdo era más fuerte que la de la carne de ave.

El hidrogel sintetizado a partir de polielectrolitos se hincha más debido a la repulsión de carga entre las cadenas poliméricas29. Una propiedad como la hinchazón es deseable para la liberación controlada del fármaco30. El GbH está diseñado para el cuidado de heridas como material de apósito y, por lo tanto, la presente formulación se cargó con tres medicamentos distintos, a saber. ciprofloxacina (fármaco antibacteriano), 5-flucitosina (fármaco antifúngico) y quercetina (fármaco que promueve la cicatrización de heridas) (Tabla 3). En el presente estudio, el GbH se cargó con diferentes concentraciones de fármaco (un mínimo de 5 mg/mL y un máximo de 20 mg/mL) dependiendo de la saturación y concentración efectiva de los fármacos a difundir. Los fármacos se solubilizaron en dimetilsulfóxido (DMSO) y se cargaron 200 μl de fármacos con gelatina. También se llevó a cabo un estudio de una combinación de fármacos (ciprofloxacina (100 µL) y quercetina (100 µL)), ya que la cicatrización de heridas requiere tanto protección bacteriana como fármacos que promuevan la cicatrización. El GbH sin ningún fármaco se incluyó como control para propiedades comparables.

El GbH había mostrado un buen hinchamiento en varios disolventes y era comparable al control (Fig. 2a). Además, la naturaleza hinchable facilita la absorción de exudados y promueve un ambiente adecuado para la cicatrización de heridas. La GbH no se disolvió en ninguno de los disolventes de prueba y se observó que el porcentaje de hinchamiento de la GbH sumergida en sangre se debía mayormente a los componentes sanguíneos29. En el estudio actual, la capacidad de hinchazón se vio comprometida de manera insignificante a medida que aumentaba la concentración del fármaco. Como candidato para apósito para heridas, se prefiere un hidrogel con un valor bajo de transmisión de vapor de agua (WVT) (Tabla 4), ya que la pérdida de líquido es limitada y se mantiene una atmósfera húmeda suficiente para la cicatrización de la herida22. Los informes indican que se experimenta una pérdida promedio de agua de ~ 250 g/m-2/d-1 en la piel normal a 35 °C, mientras que en una herida, la pérdida de agua aumenta considerablemente a 5000 g/m-2/d-1. y la pérdida se basará en la naturaleza de la lesión31. Se encontró que el GbH cargado con fármaco tenía un WVT comparativamente bajo y es comparable al control. Cuanto mayor es el agotamiento del agua, más imposible es que la herida cicatrice32. Por lo tanto, la hinchazón, el WVT y la capacidad de retención de humedad (MRC) son parámetros esenciales en los hidrogeles, que fomentan la absorción del exudado y limitan la transferencia de agua para garantizar una condición propicia para la cicatrización de la herida, proporcionando así una difusión adecuada del fármaco. Hubo un MRC razonablemente fuerte en la GbH preparada (Tabla 4) y todos los valores de MRC mostraron una diferencia insignificante con respecto al control (Tabla 4) (GbH sin fármaco). Los hallazgos mostraron una reticulación adecuada incluso después de que el GbH hubiera sido expuesto a 4 días de inmersión en agua destilada. La GbH preparada tenía una fracción de gel (GF) muy fuerte (Tabla 4) y todos los valores de GF fueron comparables a los del control.

Caracterización de la GbH: Evaluación física de la GbH: (a) comportamiento de hinchamiento de la GbH en agua, solución de NaCl, solución de MgCl2 y sangre. La imagen SEM: (b) y (c) controlan GbH con un tamaño de poro que oscila entre 266 y 393 nm; (b.1) GbH cargada con fármaco antibacteriano ciprofloxacina; (b.2) cicatrización de heridas que promueve la GbH cargada con fármaco quercetina; (b.3) fármaco antifúngico GbH cargado con 5-flucitosina; (b.4) Combinación del fármaco antibacteriano ciprofloxacina y GbH cargada con quercetina. (c.1) Imagen SEM del parche-A GbH antes de la liberación de ácido salicílico; (c.2) Imagen SEM del parche-A GbH después de la liberación de ácido salicílico (c.3) Imagen SEM del parche-B GbH antes de la liberación de ácido salicílico; (c.4) Imagen SEM del parche B GbH después de la liberación de ácido salicílico. Características funcionales de la superficie ilustradas: (d) FT-IR de hidrogel estándar y GbH; (e) FT-IR de GbH con el fármaco antibacteriano ciprofloxacina (C) cargado, fármaco promotor de la cicatrización de heridas, quercetina cargado (Q), GbH con el fármaco antifúngico 5-flucitosina (5F) cargado, GbH con el fármaco antibacteriano ciprofloxacino y quercetina combinados (Q + C) cargado y GbH con fármaco antifúngico 5-flucitosina y quercetina combinados (Q + 5F) cargado; (f) FT-IR de los parches A y B. Caracterización DSC de parches: (g) GbH y (h) parche-A y -B. (i) XRD del GbH como parche-A y -B.

Se descubrió que la superficie de GbH era densa en las imágenes del microscopio electrónico de barrido (SEM) y, con un aumento muy alto, se veían pocos poros, en un rango de 266 a 393 nm (Fig. 2b, c). Una superficie densa resulta beneficiosa como apósito para heridas, ya que no favorece que las bacterias se infiltren en el sitio de la lesión y causen infección fácilmente15. Una investigación similar sobre formulaciones de almidón de PVA encontró partículas de almidón insolubles en la superficie33 que no eran visibles en la superficie de GbH29. La observación de que no hay cambios en la superficie en comparación con el GbH de control indica que los fármacos se mezclaron de manera apropiada (uniforme/adecuadamente) con el GbH, lo que garantiza un proceso de carga uniforme del fármaco (Fig. 2b.1-4, b.1-4). Aunque el GbH es de naturaleza translúcida, su color se puede cambiar según el fármaco cargado. El color del GbH cambió a amarillo y lechoso turbio cuando se agregaron quercetina y 5-flucitosina, respectivamente.

Los espectros IR del hidrogel y GbH (Fig. 2d) mostraron un pico amplio en el rango de 3300 a 3500 cm −1, derivado del estiramiento intermolecular de O – H de los componentes34. El pico observado a 1636 cm −1 corresponde a la vibración N – H de la polidopamina (Fig. 2d), que evidentemente se observó en todos los espectros. Dado que los espectros no mostraron bandas de aldehído características, no habrá exceso de glutaraldehído. No hubo reducción en la intensidad de las bandas O – H incluso después de la incorporación de fármacos (Fig. 2e), lo que indica la abundancia de grupos O – H hidrófilos aportados por sus componentes. Las investigaciones indican que las características adhesivas de los hidrogeles están asociadas principalmente con los grupos O-H de la superficie del hidrogel que interactúan con grupos químicos como hidroxilo, amino y carboxilo en la superficie de los tejidos27,28,35. El pico a 1141 cm-1 reveló un estiramiento de C-O que surge debido a los enlaces de hidrógeno intermoleculares formados entre cadenas vecinas de PVA36. La vibración de estiramiento exhibida por el enlace C-O en los grupos C-O-C del almidón se encontró a 1025 cm-1 en el GbH, mientras que los picos correspondientes al estiramiento C-O de la gelatina se encontraron a 1080 cm-1. y 1030 cm −1 en los espectros de GbH (Fig. 2d). El pico que surgió debido a la presencia de un grupo amida secundario se fusionó con la banda N – H de polidopamina a 1636 cm-1. Los espectros de GbH conservaron todos sus picos característicos en la región respectiva, revelando que no se produjeron interacciones químicas ni cambios estructurales tras la incorporación del fármaco (Fig. 2e y f).

El comportamiento térmico del GbH se estudió con termograma de calorimetría diferencial de barrido (DSC). El pico endotérmico de fusión para GbH se observa a 199 ° C (Fig. 2g). Esto se puede atribuir principalmente al componente principal como PVA; sin embargo, la Tm observada aquí es menor que la informada en la literatura para PVA puro, principalmente debido a las interacciones entre las cadenas de PVA y otros componentes, lo que lo convierte en una naturaleza amorfa del GbH37. El GbH es térmicamente estable hasta 200 ° C, mientras que el GbH incorporado al fármaco exhibió una Tm más alta a 216 ° C, atribuido a la interacción física entre el fármaco y el GbH (Fig. 2h). La característica cristalina o amorfa se revela mediante difracción de rayos X en polvo (DRX) con un pico en 2θ = 9,4°, que representa el pico semicristalino de PVA38. La presencia de almidón en todos los casos fue evidente debido a la presencia de un pequeño pico en el hombro a 9° (Fig. 2i). La intensidad de los picos disminuyó con la incorporación de los fármacos. La intensidad disminuida de los picos en los parches A y B revela la naturaleza amorfa de GbH.

El perfil de liberación del fármaco se evaluó utilizando una dosis de ácido salicílico al 1%. Se implementaron dos enfoques: parche-A, donde se preparó y dispersó el GbH en ácido salicílico; parche-B, donde el GbH se sumergió en 10 ml de solución de ácido salicílico en acetona hasta que la solución se evaporó. La prueba de elongación de los parches indicó que el método de integración del fármaco no alteró la elongación de GbH (Tabla 5). Los parches mostraron un alargamiento igual al de los parches de control, es decir, el GbH sin fármaco.

La secuencia de liberación del fármaco (Fig. 3a) de los parches representó que tanto el parche A como el B exhiben un porcentaje de liberación controlada del fármaco (CDR%) de 60,39 ± 2,25 % y 57,08 ± 2,02 %, respectivamente, dentro de un período de 4h. Los parches A y B mostraron favorablemente un patrón idéntico con liberación lenta; por tanto, se observó un patrón de liberación regulada del fármaco. Una investigación comparable con hidrogel de gelatina registró el 100% de la liberación del fármaco en 4 h, mientras que el GbH exhibió solo el 60% de liberación del fármaco. Los estudios sugieren que la liberación del fármaco fue más rápida y el equilibrio alcanzado fue a las 3 h en un ambiente con suficiente medio de disolución39. Se observó que los parches A y B tenían una capacidad de carga de fármaco de 13,48 ± 0,17 y 11,42 ± 0,15 mg, respectivamente. El proceso de carga del fármaco mostró diferencias menores en las propiedades de la GbH, y el parche B mostró una pérdida parcial (Tabla 5) en términos de elongación. El sistema de fundición de solución es eficiente y tiene un gran potencial para la carga de fármacos en la presente investigación. La investigación de la liberación del fármaco por difusión en agar produjo un color violeta/púrpura en las placas de agar debido a una reacción compleja entre el ácido salicílico difundido y el cloruro férrico (Fig. 3b,c), donde el gráfico muestra la zona de liberación del fármaco frente al tiempo, lo que determina la cinética de liberación del fármaco (Fig. 2c). Según el diámetro de la zona formada debido a la liberación del fármaco, se observaron las características de liberación controlada de la GbH. La liberación de ácido salicílico fue lenta y se pudo observar mediante la expansión del anillo en función del tiempo. La GbH demuestra ser la formulación ideal para la difusibilidad del fármaco, que puede explicarse mediante más observaciones cinéticas matemáticas.

Modelado matemático para el sistema de administración transdérmica de fármacos: evaluación dependiente del tiempo de la liberación de ácido salicílico de GbH: (a) ilustración gráfica del análisis espectrofotométrico del perfil de liberación controlada de fármaco del parche A y B para ácido salicílico; (b) ilustración de la prueba de difusión en pozo de agar para el perfil de liberación controlada del fármaco del parche A y B; (c) ilustración gráfica del perfil de liberación controlada del fármaco de los parches A y B para la prueba de difusión en pozos de agar con ácido salicílico. Representación del modelo matemático de la liberación de fármacos de GbH: (d) orden cero, (e) primer orden y (f) cinética de liberación de Higuchi. Difusión en agar de GbH: (gA) rendimiento de GbH estéril por UV contra E. coli; (gB) Placa de control del rendimiento de GbH estéril con UV contra E. coli; ( gC ) Rendimiento de GbH estéril con UV contra S. aureus; (gD) Placa de control del rendimiento de GbH estéril con UV contra S. aureus; (gE) Rendimiento de GbH no estéril contra E. coli; (gF) Placa de control del desempeño de GbH no estéril contra E. coli; (gG) Rendimiento de GbH no estéril contra S. aureus; (gH) Placa de control del desempeño de GbH no estéril contra S. aureus; (gI) rendimiento de GbH estéril con UV contra C. albicans; ( gJ ) Placa de control del rendimiento de GbH estéril con UV contra C. albicans; (gK) Rendimiento de GbH no estéril frente a C. albicans y (gL) Placa de control del rendimiento de GbH no estéril frente a C. albicans. (h) ilustrar el rendimiento de la superposición de agar de GbH donde E, S y CA denotan E. coli, S. aureus y C. albicans, respectivamente; C indica placa de control; C(H) indica GbH de control positivo; D(H) indica GbH cargada con el fármaco de prueba. (i) ilustra el rendimiento del agar parche de GbH donde D1, D2 y D3 son los días 1, 2 y 3, respectivamente; E, S y CA indican E. coli, S. aureus y C. albicans, respectivamente; C denota parche de algodón; D(C) denota un parche de algodón cargado de droga; H denota GbH y D(H) denota GbH cargada de fármaco.

El valor de % de CDR se considera además para el análisis del modelo estadístico del patrón de liberación del fármaco GbH. Se trazaron las cinéticas de liberación en cero (Fig. 3d), primer orden (Fig. 3e) y Higuchi (Fig. 3f) del patrón de liberación del fármaco para los parches A y B40. Los gráficos reflejan la forma estadística de la formulación de liberación transdérmica del fármaco. En un análisis de modelo de orden cero, los datos de los ensayos de liberación de fármacos in vitro se representan como la cantidad total de fármaco liberado frente al tiempo (Fig. 3d). Esta relación puede explicar la difusión de las formas de liberación de fármacos, incluidos los sistemas transdérmicos, las tabletas matriciales con fármacos poco solubles en formas recubiertas y los sistemas osmóticos41. El modelo de primer orden representa un porcentaje logarítmico acumulado del fármaco restante frente al tiempo, lo que dará como resultado una línea recta con una pendiente de − K/2303 (Fig. 3e). Esta asociación se puede utilizar para categorizar la disolución de fármacos en tipos de dosificación recetados, como aquellos que comprenden fármacos solubles en agua en matrices porosas41. La cinética de Higuchi se ocupa únicamente del porcentaje total de liberación del fármaco frente a la raíz cuadrada del tiempo (Fig. 3f). Esta correlación se puede utilizar para explicar la disolución del fármaco en muchos tipos de formulaciones farmacéuticas de liberación modificada, como los sistemas transdérmicos y las tabletas matriciales con fármacos solubles en agua41.

La liberación del fármaco de ácido salicílico desde la matriz de GbH se ajusta al concepto de cinética de orden cero y de primer orden (para el parche A, r2 = 0,984 y r2 = 0,99; para el parche B, r2 = 0,894 y r2 = 0,95, respectivamente) (Fig. 3d,e). El parche A también sigue la cinética de Higuchi con un coeficiente de correlación relativamente cercano (r2 = 0,952), pero el parche B tuvo un valor más bajo que el parche A (Fig. 3f). El parche B tiene un valor más bajo en el modelo cinético de orden cero en comparación con el parche A (Fig. 3d). De manera similar, un informe anterior sobre los modelos matemáticos de hidrogel a base de gelatina reveló que el hidrogel desarrollado de la misma manera que el parche B tiene una menor liberación de fármaco que el parche A debido a que los complejos esterificados obstaculizan la liberación de la molécula salicílica39. De acuerdo con la validación de los modelos matemáticos para un sistema de administración transdérmica de fármacos, el parche A sigue perfiles de liberación de tres fármacos, es decir, modelo de orden cero, de primer orden y de Higuchi, pero el parche B tuvo un valor menor en comparación con el parche. -A para el modelo higuchiano y de orden cero. Se ha observado un patrón de liberación de fármaco similar para el diclofenaco sódico atrapado en hidrogeles a base de polietilenglicol y polietilenglicol-policaprolactona42. Los parches A y B, como se mencionó, obedecen las tres leyes cinéticas, donde el proceso de difusión libera ácido salicílico. El fármaco utiliza el mismo canal utilizado para difundirlo en la matriz, lo que puede confirmarse mediante análisis SEM antes y después de la liberación del fármaco del parche A (Fig. 2c.1, c.3). La superficie rugosa observada antes de la liberación es una superficie lisa en las imágenes SEM posteriores a la liberación del fármaco (Fig. 2c.2, c.4) del parche B, que es comparable a la superficie del control GbH (Fig. 2c). Los resultados de IR (mencionados en la sección "Caracterización de GbH" y en la Fig. 2f) mostraron la presencia prominente del grupo funcional O – H en la superficie de GbH y la carga del fármaco no alteró mucho los grupos funcionales de la superficie.

Los apósitos de hidrogel mantienen principalmente húmeda la zona de la herida y la protegen de infecciones. La porosidad observada en el análisis SEM de GbH (sección: "Caracterización de GbH" y Fig. 2b, c) es indicativa de ventajas como alta concentración local del ingrediente activo, liberación lenta e hinchazón. La difusión del fármaco desde GbH se probó contra microorganismos (Escherichia coli MTTC 443, Staphylococcus aureus MTTC 96 y Candida albicans MTTC 183) utilizando métodos basados ​​en agar, como difusión en agar, superposición de agar y agar parche. Estos métodos muestran la eficiencia de liberación de fármacos del GbH y su desempeño en el control de infecciones. En la presente investigación, la GbH esterilizada y no esterilizada en superficie (Fig. 3 gA – gL) se analizó mediante el método de difusión en agar. El GbH demuestra una fuerte difusibilidad tanto en concentraciones más bajas como más altas de fármacos, es decir, 5 mg y 20 mg. Los dos anillos distintos observados en la zona de inhibición podrían deberse a la lenta difusividad del fármaco desde la GbH. El gel esterilizado o no esterilizado tiene poco efecto sobre la difusibilidad del fármaco a través de GbH. El sistema de superposición de agar (Fig. 3h) mostró una fuerte difusibilidad del fármaco en concentraciones más bajas (5 mg) y el GbH con los fármacos de prueba no mostró crecimiento microbiano en comparación con los controles. Por lo tanto, el GbH es una opción exitosa para la protección de heridas contra infecciones bacterianas (Fig. 3g.A – gH) y fúngicas (Fig. 3g.I – gL).

Las pruebas y los controles, como en la investigación con agar parche (Fig. 3i), se infectaron con un hisopo de E. coli gramnegativo y S. aureus grampositivo para estudios antibacterianos incubados a 37 °C. Se inocularon placas antifúngicas con C. albicans y se incubaron a 27 °C. El estudio se realizó durante un período de tres días en los que se tomó un hisopo del área contaminada y se monitoreó el crecimiento bacteriano y fúngico en placas de agar nutritivo y agar papa dextrosa, respectivamente. Los hallazgos actuales (Fig. 3i) mostraron que el GbH cargado con medicamentos realizó una actividad antimicrobiana superior en comparación con el GbH sin medicamentos ni controles. Se observó un espeso crecimiento microbiano en la muestra del parche de algodón cargada con fármaco desde el día 1. El sistema de agar del parche cargado con fármaco y sin fármaco demostró la capacidad del GbH para evitar infecciones gracias a su vendaje suave para heridas con una fuerte propiedad de difusividad. .

La toxicidad de la GbH se evaluó en tres niveles mediante el ensayo MTT. El ensayo de primer nivel utilizando líneas celulares L929 permitió seleccionar el estabilizador apropiado, lo que hizo que el GbH no fuera tóxico. Los ensayos de segundo nivel determinan la viabilidad celular durante el contacto indirecto de la GbH (lixiviado de GbH) con líneas celulares 3T6. Finalmente, en el tercer nivel, se demostró la inercia del GbH para el contacto directo e indirecto (lixiviado de GbH) del GbH utilizando células HaCat. Varios estabilizantes, como la quercetina (QU), el eugenol (EU), la vitamina C (Vc) y el metaperiodato de sodio (SmP), se sometieron a ensayos de MTT en diferentes concentraciones (1:0,5, 1:1, 1:1,5 y 1: 2) de la relación polidopamina-estabilizador (Fig. 4a). Curiosamente, se observó una viabilidad celular razonable de ~ 50% en una proporción 1:1 de polidopamina a metaperiodato de sodio. Por lo tanto, se eligió la SmP como estabilizador para los ensayos de segundo nivel utilizando estándares polacos43. La evaluación MTT de la toxicidad del medio lixiviado del biomaterial en células 3T6 reveló sus propiedades no tóxicas. Entre las proporciones de polidopamina y estabilizador, SmP (1:1, 1:2, 1:3 y 1:4) comparadas aquí, 1:4 mostró una viabilidad celular> 80% (Fig. 4b), que fue aún más probado en varias cantidades reemplazando el 100% del medio de crecimiento con el medio de lixiviado de biomaterial (Fig. 4c). Aunque se reemplazaron varios porcentajes (25, 50 y 100%) del medio lixiviado del biomaterial, no hubo un impacto negativo importante del GbH en la viabilidad de las células 3T6 y fue comparable a los controles, es decir, el hidrogel de almidón PVA y el Base GbH. El ensayo MTT final se llevó a cabo en la línea celular HaCat (Fig. 4d) con dos métodos diferentes, contacto directo e indirecto de GbH (Fig. 4d.1). La viabilidad celular no se vio afectada, es decir, 100% en ambos métodos de prueba y los valores observados fueron comparables a los controles de crecimiento (Fig. 4d).

Rendimiento in vitro e in vivo de GbH como material de apósito para heridas por quemaduras de segundo grado: Evaluación de citotoxicidad de GbH utilizando células L929: (a) Viabilidad celular de L929 cuando se expone a GbH durante 24 h, donde Hb es una base de hidrogel sin estabilizador y la leyenda indica la concentración (mg) de cada estabilizador de prueba; (b) Viabilidad celular de 3T6 cuando se expone al medio lixiviado GbH durante 24 h, donde Ctr es la base GbH sin estabilizador y la leyenda denota la proporción de polidopamina a metaperiodato de sodio y (c) Viabilidad celular de 3T6 cuando se expone al Medio lixiviado de GbH durante 24 h en un porcentaje diferente, donde Ctr es la base de GbH sin estabilizador y la leyenda de la relación indica la relación de polidopamina y metaperiodato de sodio en GbH. (d) Viabilidad celular de HaCat cuando el GbH está en contacto con las células (GbH colocado) y el medio lixiviado al 100% de reemplazo del medio se incuba durante 24 h, donde Ctr denota control, Ctr 37 °C denota control positivo; (d.1) Evento observado de células HaCat sanas después de 24 h en contacto con GbH, donde la flecha blanca indica GbH y la flecha negra indica células HaCat sanas en una placa de 96 pocillos. Desarrollo observado de artemia cuando se exponen a GbH durante 24 h, (e) Control positivo: nauplios del tanque aireado; (e.1) Control: nauplios en agua salada artificial; (e.2) y (e.4) Prueba: nauplios en medio 1:1 del tampón sanguijuela GbH y agua salada artificial; (e.3) y (e.5) Prueba: El GbH colocado en artemia en un medio artificial de agua salada. Prueba de toxicidad a corto plazo en etapas de embrión y alevines del modelo de pez cebra: (f) Desarrollo observado del pez cebra cuando se expone a GbH (contacto directo de GbH y medio 1:1, es decir, el tampón con sanguijuela de GbH y el medio E3) durante 18 –96 hpf; (f.1) Huevos de pez cebra sanos observados a 48 hpf en contacto con el GbH. Fotomicrografías que muestran la histopatología de la piel en ratas. Aspectos normales del epitelio en las ratas macho (g) y hembra (g.1) del grupo control. Acantosis mínima de las ratas macho (g.3) y hembra (g.4). Aspecto normal de la dermis en la rata control (g.2) e infiltración celular inflamatoria mínima en el grupo tratado (g.5).

El efecto del contacto directo e indirecto de la GbH se exploró mediante ensayos basados ​​en modelos in vitro utilizando embriones de artemia (Artemia salina) y pez cebra (Danio rerio). El ensayo de letalidad de la artemia es una prueba rápida para evaluar la citotoxicidad44. El GbH sumergido en tampón fosfato, incubado a 35–37 °C durante 24 h, se utilizó como solución de prueba para el ensayo de artemia. Los nauplios eclosionados de 24 h (n = 10) se inocularon en diferentes proporciones (1:4, 1:1 y 1:0) de la solución de prueba y agua de mar artificial. El desarrollo de los jóvenes activos hasta la etapa naupliar con un crecimiento saludable en el tamaño del cuerpo y el cabello de las antenas (Fig. 4e-e.5) fue indicativo de la naturaleza no tóxica de la solución de prueba de GbH. Las muestras de contacto directo del GbH sumergido en agua de mar también mostraron un patrón de crecimiento similar al del nauplio. Se observó una tasa de mortalidad del 10 % en la proporción 1:0 utilizada en el ensayo indirecto, lo que se atribuye a la presencia de un bajo contenido de agua salada. Mientras que se observó una tasa de mortalidad del 15% en el contacto directo de las muestras sumergidas en GbH debido a los nauplios enredados en el GbH. (Figura 4e.5)45. Los controles mantenidos en las placas incubadas y en la pecera aireada mostraron patrones de crecimiento nauplio similares.

El ensayo de prueba de embrión de pez (FET) utilizando embriones de pez cebra (n = 10) (Fig. 4f,f.1) se realizó de manera similar al ensayo de letalidad de camarón en salmuera con una ligera modificación utilizando medio E346. Los embriones se observaron cada día para registrar cualquier cambio en el desarrollo debido a su exposición directa al GbH y a la solución de prueba sanguijuela de GbH de acuerdo con las directrices de la OCDE para probar productos químicos n.° 212: peces, prueba de toxicidad a corto plazo en embriones y alevines. etapas47,48. Las observaciones apicales se realizaron en cada embrión analizado (Fig. 4f, f.1) cada 24 h hasta 96 h después de la fertilización (hpf) y la escala de gravedad (Tabla 6) de la toxicidad del GbH en el desarrollo de los embriones. fue grabado. Las otras observaciones incluyeron el desarrollo de los ojos, el movimiento, la circulación sanguínea y la pigmentación, el desarrollo de la cabeza y el cuerpo, la aleta pictórica y la boca protuberante49. Además, se documentó el comienzo de la eclosión a ~ 72 h tanto en el grupo de tratamiento como en el de control (Fig. 4f, f.1). Los resultados negativos (Tabla 6) en la escala de gravedad indicaron el desarrollo saludable del embrión de pez cebra tras el contacto directo e indirecto con el GbH.

El experimento de toxicidad dérmica aguda se llevó a cabo de acuerdo con las directrices reglamentarias de la OCDE-402 para pruebas de productos químicos50. El estudio confirmatorio y de búsqueda del rango de toxicidad se realizó utilizando ratas albinas Wistar sanas seleccionadas (n = 10) después de la aclimatación. El material de prueba, GbH, no produjo mortalidad ni mostró ningún signo clínico de toxicidad (Tabla 7) en las pruebas en ratas albinas Wistar durante todo el período de observación (14 días). En las condiciones de prueba de OECD-402, el experimento no produjo la LD50 dérmica de GbH en ratas y la formulación no fue tóxica hasta 2000 mg/kg de peso corporal (> 2000). Las ratas expuestas a GbH sobrevivieron al protocolo experimental y fueron sacrificadas, ya que no se requirió la necropsia (Tabla 8). Los resultados histopatológicos (Fig. 4g-g.5) no muestran claramente signos de inflamación o anomalías en la región aplicada de GbH en los grupos de hombres y mujeres.

El ensayo de herida por raspado in vitro demostró una migración celular eficiente en los raspaduras en las células HaCat, que fueron expuestas al lixiviado de GbH y GbH cargada de quercetina en el medio (Fig. 5a). La raya de la monocapa celular se cerró parcialmente en comparación con los controles dentro de las 24 h posteriores a la exposición al medio lixiviado del biomaterial. Las imágenes capturadas a intervalos fueron calificadas para demostrar la naturaleza no tóxica de los GbH, que favorecen una migración celular eficiente para el cierre de la herida51. Se observó el cierre de la brecha artificial, 'el rasguño', en la monocapa de células confluentes de células HaCat, donde las células en el borde de la brecha recién creada se movieron hacia la abertura para cerrar el 'rasguño'. Por lo tanto, se establecieron nuevamente nuevos contactos célula-célula en la GbH cargada y no cargada de quercetina (Figura a. 24 hQ-GbH). Se ha informado de una observación similar del cierre eficiente de la herida mediante un ensayo de raspado isquémico in vitro con niveles bajos de infiltración de células inmunes y citoquinas debido a la quercetina52. Informes anteriores sobre el análisis de liposomas cargados de quercetina desarrollados en diferentes cantidades de carbopol y gelatina condujeron a una curación acelerada de la lesión, disminuyendo sustancialmente el tiempo de cierre de la herida53. Numerosos investigadores han desarrollado la quercetina como fármaco modelo para promover la cicatrización de heridas54,55.

Rendimiento de curación de heridas de GbH: (a) Rendimiento de curación de heridas por raspado de células HaCat en 100% reemplazado del medio incubado con GbH. (b) Cambios en la resistencia a la tracción de la piel en los grupos tratados con Normal, Control, base de crema (Crema), crema cargada con quercetina (QC), base GbH (Hidrogel), GbH cargada con quercetina (QH) y sulfadiazina de plata (SS). Los resultados se representan como la media ± DE con n = 6 en cada grupo ap < 0,05 en comparación con el grupo Normal; pb < 0,05, en comparación con el grupo de control; cp < 0,05, en comparación con el grupo Crema, dp < 0,05, en comparación con el grupo QC, ep < 0,05, en comparación con el grupo Hidrogel, fp < 0,05, en comparación con el grupo QH, gp < 0,05, en comparación con el grupo SS. (c) El efecto de los tratamientos sobre la contracción de la herida por quemadura (%) los días 4, 7, 11, 14 y 21 fue una contracción de la herida superior y más rápida en comparación con los grupos de control y placebo. (d) Cambios en la contracción de la herida de los grupos tratados con normal, control, crema, QC, hidrogel, QH y SS.

La ingesta nutricional, el consumo de agua y la masa corporal de las ratas Wistar que sufrieron quemaduras se mantuvieron inalteradas. Inmediatamente después de la quemadura, la piel de la región dorsal mostró hinchazón. Las lesiones eran evidentes en forma de manchas rojas a partir del día 4 y se encontró que los tejidos necróticos estaban cubiertos con una costra el día 7.

Se observó una epitelización temprana de las heridas (Tabla 9) en los grupos tratados a los que se les administró quercetina al 1% del grupo tratado con GbH (QH) y sulfadiazina de plata (SS). El grupo de control no mostró una cicatrización adecuada de las heridas hasta el día 21, mientras que QH y SS exhibieron una epitelización temprana de las heridas desde los días 14 y 16, respectivamente. Los grupos de placebo (es decir, el grupo tratado con base de crema (Crema) y el grupo tratado con base de GbH (Hidrogel) observaron una epitelización temprana desde los días 16 y 17. Los grupos de placebo significan el efecto positivo de la formulación de GbH y crema cargada con el medicamento.

Las muestras de tejido de prueba se sujetaron con una máquina y la fuerza máxima generada para rasgar las muestras indicó la calidad del tejido. Se observó una diferencia significativa en la resistencia a la tracción del tejido (Fig. 5b) entre el control y todos los grupos de tratamiento (p <0,05). Lo que indica la necesidad de cuidar las heridas por quemaduras, la resistencia a la tracción de los grupos QH y SS fue de 24,4 y 23,37 N, respectivamente, mientras que el grupo de control registró 3,77 N. Una mejor resistencia a la tracción de los grupos QH y SS fue de un rango similar, mientras que el grupo placebo tratado con Crema e Hidrogel base mostró 10,1 N y 19,32 N con una diferencia significativa (p < 0,05) en comparación con la formulación cargada con el fármaco, enfatizando así el papel positivo de la GbH en la cicatrización de heridas por quemaduras. La recuperación de la resistencia a la tracción de QH y SS demostró la normalización de la piel con una resistencia a la tracción de 28,45 N para el día 21.

El porcentaje de contracción de la herida (Fig. 5c, d) fue significativamente mayor (p <0,05) para los grupos QH y SS en comparación con el grupo de control. El resultado del cierre de heridas mediado por GbH en quemaduras de segundo grado en el modelo de rata ha demostrado ser beneficioso. Los animales tratados con QH mostraron un cierre de heridas más sustancial (45,00 ± 1,46 % el día 4; 98,24 ± 3,1 % el día 14) que los tratados con SS (47,67 ± 1,8 % el día 4; 96,4 ± 2,2 % el día 14) y el grupo de control no tratado (18,00 ± 2,5% el día 4; 54,52 ± 1,25% el día 14) el día 4 y el día 14, respectivamente (Fig. 5,d). Los estudios morfológicos generales mostraron una disminución de la inflamación y el enrojecimiento y cicatrices limitadas en el grupo QH el día 14. Además, la epidermis rejuveneció hasta alcanzar la arquitectura normal de la piel en las heridas tratadas con QH y SS, mientras que se observaron signos de inflamación y cierre prematuro de la herida en el grupo QH. grupos de control el día 21 (Fig. 5d)

Los niveles de malondialdehído (MDA) (Fig. 6a) de las muestras de tejido tratadas con QH se registraron como 0,814 nmoles MDA/ml y fueron más bajos que los del grupo control (p <0,05) con 2,147 nmoles MDA/ml, mientras que la piel normal se registró como 0,705 nmoles MDA/ml. Un aumento sustancial (p < 0,05) en el grupo de control MDA es un signo de daño por peróxido lipídico, lo que significa daño por radicales libres, lo que lleva a una cicatrización incompleta de la herida en el día 21. Los niveles de MDA de los grupos tratados con QH y SS fueron 0,814 y 0,827 nmoles MDA/mL, respectivamente e idénticos entre sí y comparables al tejido cutáneo normal. Los niveles reducidos de MD en las muestras tratadas con QH indican el efecto de la quercetina en la reducción de la peroxidación lipídica y la protección antioxidante durante la curación de heridas por quemaduras. Anteriormente se informó sobre la protección antioxidante contra la lesión oxidativa inducida por quemaduras mediante el uso de tratamiento oral y tópico de mirto (Myrtus communis)56. Por tanto, la inversión de los índices bioquímicos se atribuye al potencial efecto antioxidante de los compuestos antiinflamatorios.

Cambios en la cicatrización de heridas in vivo en (a) MDA; b) GSH; c) CAT; (d) HXP; (e) Niveles de HXA y (f) NF-κB del grupo Normal, Control, base de crema (Crema), crema cargada de quercetina (QC), base GbH (Hidrogel), GbH cargada de quercetina (QH) y sulfadiazina de plata (SS) grupos tratados. Los resultados se representan como la media ± DE con n = 6 en cada grupo ap < 0,05 en comparación con el grupo Normal; pb < 0,05, en comparación con el grupo de control; cp < 0,05, en comparación con el grupo Crema, dp < 0,05, en comparación con el grupo QC, ep < 0,05, en comparación con el grupo Hidrogel, fp < 0,05, en comparación con el grupo QH, gp < 0,05, en comparación con el grupo SS. Imagen 2D y 3D de la interacción de la quercetina con: (g) y (g.4) interacción objetivo 1SVC; (g.1) y (g.5) interacción objetivo 3BRV; (g.2) y (g.6) interacción objetivo 1NFI, y (g.3) y (g.7) interacción objetivo 2E7A.

Tanto los antioxidantes enzimáticos como los no enzimáticos, es decir, el glutatión (GSH) y la catalasa (CAT), respectivamente, desempeñan un papel destacado en la regulación dinámica de los niveles de oxígeno reactivo y su daño previsto, favoreciendo la cicatrización de heridas57,58. En las muestras de control, los niveles de GSH (Fig. 6b) y CAT (Fig. 6c) se registraron como 2,24 µmol/g y 14,83 µmoles de peróxido de hidrógeno utilizado/mg/tejido/min, respectivamente. Se observó una reducción significativa en los niveles de GSH (Fig. 6b) y CAT (Fig. 6c) en el grupo de control en comparación con los grupos tratados y normales (p <0,05). Los grupos tratados con QH y SS tenían como objetivo restaurar la función tisular regular de GSH (2,13 y 2,14 µmol/g de tejido, respectivamente) y CAT con (22,41 y 25,341 µmoles de peróxido de hidrógeno utilizados/mg/tejido/min), que es comparable a el del grupo normal con 2,24 µmol/g de GSH tisular y 30,182 µmoles de peróxido de hidrógeno utilizados/mg/tejido/min de CAT (Fig. 6b yc). El QH restauró significativamente (p < 0,05) los niveles de GSH y CAT el día 21, en comparación con los placebos (GSH: 1,48 y 1,8 μ mol/g, y CAT: 15,533 y 18,207 μ moles de peróxido de hidrógeno utilizado/mg/tejido/ min para los grupos Crema e Hidrogel) y el grupo tratado con base de crema de quercetina al 1% (QC) con 1,65 µmol/g de tejido y 28,554 µmoles de peróxido de hidrógeno utilizados/mg/tejido/min, respectivamente.

Los niveles de hidroxiprolina (HXP) y hexosamina (HXA) en los tejidos de prueba pueden correlacionarse con la curación observada. El HXP es el elemento crítico del colágeno, mientras que el HXA son los sustratos fundamentales para la construcción de componentes del tejido conectivo59. Por tanto, los niveles de HXP y HXA representan un candidato perfecto para un marcador de tejido conectivo en la cicatrización de heridas. Durante el proceso de curación, los contenidos de HXP y HXA aumentaron en todos los grupos tratados en relación con el grupo de control (Fig. 6d y e). Los niveles de HXP y HXA del grupo quemado sin ningún tratamiento fueron 38,911 y 40,477 μg/mL, respectivamente, lo que fue significativamente menor (p < 0,05) en comparación con el del grupo normal con 97,546 y 107,752 μg/mL, respectivamente. Los grupos QH y SS restauraron sus niveles funcionales de HXP y HXA a 83.053 y 76.343, y 95.698 μg/mL y 89.22 μg/mL, como se observó en el grupo normal con 97.546 y 107.752 μg/mL para el día 21. El QH se restauró sustancialmente ( p < 0,05) los niveles de HXP y HXA en comparación con los grupos de placebo (HXP: 52,858 y 58,729 μg/mL, y HXP: 63,559 y 66,898 μg/mL para los grupos de Crema e Hidrogel) y QC (HXP: 68,160 y HXA: 73,785 μg/mL) como en el día 21. Curiosamente, el grupo SS registró 76,343 y 89,221 μg/mL de niveles tisulares de HXP y HXA, similares al grupo QH. La disminución sustancial de los niveles de HXP y HXA en el contenido del tejido de control indica niveles bajos de colágeno, formación insuficiente de tejido conectivo y un proceso de curación de heridas inadecuado. Por lo tanto, la observación en el grupo tratado con QH resalta la propiedad curativa prevista de la formulación.

Las funciones del NF-κB son varias en la cicatrización de heridas, ya que modula la inflamación y la supervivencia celular y promueve la remodelación de las uniones celulares y el ensamblaje de una estructura citoesquelética alrededor de la herida60. Los niveles de NF-κB del grupo de control fueron de 5,88 ng/ml y fueron significativamente altos (p < 0,05) en relación con el grupo normal con 3,95 ng/ml, lo que implica persistencia de la inflamación. Los grupos tratados con QH y SS restauraron sus niveles funcionales habituales de NF-κB y se observaron en 3,61 y 3,52 ng/ml, similares a los niveles de NF-κB tisular del grupo normal (Fig. 6f). El QH restauró sustancialmente (p < 0,05) los niveles de NF-κB en comparación con los placebos (5,11 y 4,75 ng/mL de niveles de NF-κB en tejido de los grupos de Crema e Hidrogel) y los grupos tratados con QC (niveles de NF-κB en tejido de 4,46 ng/mL). ) como el día 21. Por lo tanto, los resultados enfatizan el efecto de la GbH para facilitar la cicatrización de heridas y restaurar el funcionamiento esperado del NF-κB similar al de un tejido cutáneo normal.

El factor de transcripción NF-κB y la citocina multifuncional TNF-α son potentes mediadores inflamatorios que desempeñan activamente funciones predominantes en eventos celulares como la supervivencia, proliferación, diferenciación y muerte celular61. Los investigadores han establecido que la quercetina es un medicamento modelo para mejorar la cicatrización de heridas53,56, y el estudio actual destaca los efectos beneficiosos de la GbH suplementada con quercetina en la recuperación de heridas por quemaduras de segundo grado en modelos de ratas. El análisis in silico de quercetina frente a posibles objetivos mediadores inflamatorios (Fig. 6g-g.8 y Tabla 10) observó una excelente puntuación de unión y enlaces de hidrógeno a múltiples aminoácidos. El compuesto se une al dominio p50 de la proteína 1SVC, que se traslada al núcleo, donde se une al ADN (Fig. 6g, g.4). La región en espiral de 3BRV se encuentra entre las posiciones 49 a 356 (Fig. 6g.1, g.5). Muchas regiones tipo espiral están involucradas en funciones biológicas críticas, como la regulación de la expresión genética. La región entre 44 y 111 de 3BRV participa activamente en la interacción con CHUK/IKBKB, lo que permite la fosforilación de RelA/p65 mediada por IKK, que en general promueve activamente una respuesta inflamatoria a través de la activación de NF-κB. La región de dominio de 1NFI (Fig. 6g.2, g.6) entre 19 y 306 regula funcionalmente la accesibilidad del promotor del gen diana RelA. La quercetina forma enlaces de hidrógeno con aminoácidos en la región del dominio 1NFI, volviéndola funcionalmente inactiva. La mutagénesis en las posiciones 105 y 108 de la proteína 2E7A (Fig. 6g.3,g.7) ha provocado una baja actividad e inactividad62. El acoplamiento actual destaca la unión de la quercetina en la región activa de 2E7A.

La piel normal (Fig. 7a) muestra una arquitectura con una epidermis y una capa de dermis bien definidas en la evaluación histopatológica. La capa epitelial (x) está intacta sin signos de inflamación. La dermis tiene muchas glándulas sebáceas (b) y fibras colágenas bien definidas (c) en la capa superior de la dermis. En el grupo de control (Fig. 7a.1), hay una pérdida completa de la epidermis y una destrucción sustancial de las capas superficiales de la piel (d). La desintegración citoplasmática vacuolar en la capa de células basales es prominente (e) junto con la infiltración neutrofílica en el sitio de la lesión (f). La piel muestra coagulación de la epidermis y la dermis, y el colágeno desnaturalizado aparece hinchado (g), homogéneo e infiltrado por células exudativas. El grupo de placebo, grupo tratado con base de crema (Fig. 7a.2), mostró un tejido curado por quemadura con inflamación moderada, sin signos de regeneración epitelial o dérmica (h). La capa de células basales permanece degenerada (i) y marcadamente vacuolada, lo que indica una curación impedida. Las fibras de colágeno permanecen degeneradas (j) sin signos de regeneración microvascular. De manera similar, el grupo de placebo, el grupo tratado con base de hidrogel (es decir, el GbH) (Fig. 7a.4), exhibe epitelio con algunos signos de crecimiento regenerativo (k). Una disminución marginal en la vacuolización de la capa de células basales (l) indica curación del tejido y es evidente una disminución en la hinchazón de las fibras de colágeno (m).

Evaluación histopatológica de la herida por quemadura el día 21: se encontró una morfología estándar de la epidermis, la dermis y la hipodermis durante las fotomicrografías de un examen histopatológico del grupo normal (a). Se observó que el grupo de control (a.1) tenía marcadas características de desarrollo de costras quemadas en la dermis y epidermis, agregación extrema de leucocitos, congestión de los vasos sanguíneos, folículos pilosos y glándulas sebáceas. Se observaron leucocitos moderados, destrucción de vasos sanguíneos y degeneración degenerativa de los folículos pilosos y las glándulas sebáceas en la aplicación tópica de la crema y en el grupo placebo de GbH (hidrogel) (a.2) y (a.3). La crema tratada con quercetina y el grupo GbH (QC, QH) y sulfadiazina de plata (SS) (a.4), (a.5) y (a.6) no presentaron síntomas de acumulación de leucocitos, favorecidos por la regeneración del epitelio. La arquitectura de la piel restaurada refleja la regeneración de la epidermis tras la aplicación tópica de GbH cargada con quercetina, que está de acuerdo con la piel normal.

El grupo tratado con crema cargada de fármaco, es decir, QC (Fig. 7a.3), tenía como objetivo regenerar las capas de epidermis y dermis, donde su diferenciación es evidente (q). Se observa una importante restauración arquitectónica de la capa de células basales en forma de edema notablemente reducido y signos insignificantes de vacuolización (r). Sin embargo, la curación de la capa de la dermis permanece incompleta con la presencia de pequeñas vacuolas en las fibras de colágeno. Se puede observar una regeneración significativa del epitelio en el grupo de tratamiento con GbH asistido por fármacos, es decir, QH (Fig. 7a.5). La diferenciación entre las capas de epidermis y dermis parece casi restaurada a una arquitectura histológica normal (t). La presencia de glándulas sebáceas (u) indica una restauración fisiológica de la función del tejido cutáneo. La capa de células basales parece normal en forma y arquitectura, sin signos de inflamación (v). Las fibras de colágeno de la dermis no muestran signos de hinchazón ni otras características inflamatorias (w). El control positivo del grupo tratado con crema SS (Fig. 7a.6) muestra una regeneración evidente del epitelio (n). La capa de células basales muestra cambios restauradores, evidenciados por una vacuolización significativamente disminuida (o). Sin embargo, todavía se pueden observar hinchazón y edema en las fibras de colágeno (p) en niveles bajos.

La piel es el órgano más grande y esencial de nuestro cuerpo, que es una capa defensiva exterior. Los daños en la piel afectan las diversas funciones y comprometen la capacidad de trabajo y la independencia del paciente. Una lesión por quemadura es una experiencia traumática y, dependiendo de la gravedad de la herida, la cicatrización lenta, la infección, el dolor y las cicatrices hipertróficas siguen siendo un desafío importante en la investigación y el tratamiento de las quemaduras63. Una herida por quemadura experimenta una alta permeabilidad capilar debido a la exposición directa al calor, lo que hace que el plasma se escape desde los capilares al lugar intersticial. Durante una quemadura, un aumento de la fuga de plasma y de la permeabilidad capilar persiste hasta las 48 h y es máximo en las 8 h iniciales. Las heridas por quemaduras son sensibles y el paciente experimenta dolor según la gravedad de la herida. La aparición de fuga de plasma y permeabilidad capilar generalizada es un fenómeno específico de las quemaduras64. La investigación actual se centra en apósitos suaves para heridas que son pegajosos debido a la propiedad bioinspirada de la polidopamina. Dicho apósito suave para heridas puede ser beneficioso para el tratamiento de heridas por quemaduras ya que la pegajosidad del hidrogel no es extremadamente adhesiva ni resistente. Para muchos selladores a base de gelatina comercializados, los adhesivos tisulares pueden ser beneficiosos para la reparación de tejidos1,8,18. Estas lesiones tisulares requieren atención inmediata para restaurar la funcionalidad estándar de los órganos. En lesiones mayores asociadas con traumatismos o cirugías, se espera que los adhesivos tisulares sean fuertes, robustos, elásticos, no tóxicos y realicen diversas adherencias a superficies8.

La mezcla de hidrogel preparada mediante el método de fundición en solución fue translúcida y no mostró propiedades pegajosas (Fig. 8a). La mezcla de PVA-almidón y reticulado con GA sirvió como base para incorporar aún más la propiedad pegajosa. Las recientes investigaciones bioinspiradas tienden a modificar las propiedades poliméricas de los hidrogeles2,18. La práctica de utilizar dopamina polimerizada alcalina65 para inducir diversas propiedades pegajosas en la superficie en un sistema de hidrogel de poliacrilamida y bis-acrilamida ha sido informada previamente4, aunque varios investigadores han establecido su efecto cancerígeno66. La presente investigación tiene como objetivo una composición altamente biocompatible y un hidrogel bioinspirado rentable que pueda pegarse a diversas superficies utilizando dopamina polimerizada con álcali. Las estimaciones de las propiedades físicas de GbH mostraron una buena propiedad de hinchamiento en diferentes solventes que imitaban la condición fisiológica de la herida (Fig. 8a). Los hidrogeles a base de polielectrolitos, debido a la repulsión de carga en las cadenas poliméricas, resultan beneficiosos para lograr una liberación controlada del fármaco29,30. Las heridas por quemaduras exhiben una pérdida de líquido más significativa de 5000 g/m-2/d-1 en comparación con las heridas normales. La composición actual del GbH reporta valores bajos de WVT y altos de MRC y es comparable al control31. Los parámetros esenciales del porcentaje de hinchazón WVT, MRC y GF permiten la absorción del exudado y reducen la transferencia de agua desde la herida. De este modo, se garantizan las condiciones para una cicatrización eficaz de las heridas proporcionando una difusión adecuada del fármaco.

Aspectos destacados del GbH en la investigación actual: (a) Desarrollo de un hidrogel adhesivo de superficie diversa a base de gelatina bioinspirado para el cuidado de heridas por quemaduras de segundo grado; (b) Esquema de la interacción superficial del grupo catecol con el área de la herida por quemadura; (c) interacción del parche blando para heridas con el tejido de la herida; parche suave para heridas; (d) QH colocado en una herida por quemadura de segundo grado; (e) Reparación observable de la herida el día 3 (flecha) del apósito y (f) Absorción de exudados: una característica distintiva del hidrogel ideal.

El apósito para heridas dérmicas in vivo, el GbH (Tabla 11) demostró una regeneración acelerada del tejido cutáneo. El GbH se pudo eliminar fácilmente sin dejar residuos ni dolor en el modelo de rata. El pegajoso GbH confirma sus diversas prestaciones en superficies. El grupo catecol libre de la polidopamina interactúa con los grupos amina de la superficie del tejido (Fig. 8b)25. La curación de las heridas por quemaduras se mantuvo constante en el grupo de control desde el día 1 al día 7. Por otro lado, la escala de curación prevaleció en la mayoría de los grupos tratados con heridas por quemaduras a partir del día 3. El análisis histopatológico de casi todos los grupos de tratamiento mostró curación. de heridas por quemaduras, pero el QH demostró un proceso de curación mejor y más rápido que el grupo de tratamiento con formulación en crema y fue similar al grupo tratado con SS. Las formulaciones de GbH tienen una ventaja sobre las formulaciones en crema ya que las primeras pueden ser reemplazadas por nuevas formulaciones cada tres días, mientras que la formulación en crema debe aplicarse diariamente. El GbH como apósito suave para heridas (Fig. 8c) no fue doloroso para las ratas y no hubo enrojecimiento significativo ni cambios en la rutina dietética de las ratas debido a la aplicación de una quemadura de segundo grado o el apósito de GbH (Fig. 8d).

Un hallazgo notable de la presente investigación es el desarrollo de células rosadas y frescas (Fig. 8e) a lo largo del límite de la herida el día 3 con el tratamiento con GbH suplementado con quercetina (grupo QH), lo que no fue el caso con ningún otro grupo tratado. Un hallazgo reciente sobre la dosis de quercetina para promover la cicatrización de heridas favoreció una inhibición de la proteína quinasa activada por mitógenos y la activación de NF-κB en el ensayo de raspado celular in vitro, lo que favoreció la curación de las lesiones por presión52. De manera similar, el grupo de placebo también confirmó el efecto significativo de la GbH cargada de quercetina en la curación de quemaduras de segundo grado en el presente trabajo de investigación. Informes anteriores sobre un análisis de liposomas cargados de quercetina desarrollados en diferentes cantidades de carbopol y gelatina condujeron a una curación acelerada de la lesión, disminuyendo sustancialmente el tiempo de cierre de la herida53. Numerosos investigadores han desarrollado la quercetina como fármaco modelo para promover la cicatrización de heridas54,55. Asimismo, la investigación actual también enfatiza el impacto positivo de la GbH suplementada con quercetina en la curación de quemaduras de segundo grado en modelos de ratas. Para promover la curación de las heridas, las propiedades del hidrogel para absorber exudados y mantener un ambiente de curación limpio, húmedo (Fig. 8f) fueron algunos de los otros aspectos destacados del GbH en la presente investigación.

Es fundamental considerar que la cicatrización de heridas es un proceso complejo que involucra diversos factores, como un ambiente húmedo y cálido. Por lo tanto, tal como se centra en la "teoría de la curación de heridas húmedas", una condición de curación húmeda es ideal para el desarrollo del tejido de granulación y favorece la separación de las células dérmicas. La formulación de GbH reconoce estos elementos cruciales y facilita la rápida cicatrización de heridas al absorber el exceso de exudados y permitir el intercambio de oxígeno y vapor de agua. También protege contra las invasiones microbianas. El GbH, formulado en la presente investigación, no es tóxico, no alergénico, conveniente y rentable. Tiene una característica de administración controlada de fármacos y propiedades que le permiten adherirse a diferentes superficies, como implantes médicos y superficies de heridas húmedas o secas. El GbH se puede utilizar como parche antiinfeccioso preventivo para controlar las infecciones bacterianas o fúngicas en la piel. El GbH desarrollado se validó como material de apósito ideal para quemaduras parciales de segundo grado en modelos de ratas. Los hallazgos anteriores culminan en el hecho de que la formulación bioinspirada de GbH puede mejorar la cicatrización de heridas y la reparación de la piel de quemaduras de segundo grado en modelos de ratas, validando así su uso preclínico.

Una descripción detallada de los materiales y métodos está disponible en Materiales y métodos SI.

El experimento se llevó a cabo en el Instituto de Investigación y Toxicología Industrial, F-209, UPSIDC, MG road, Ghaziabad-201302, India y el experimento fue etiquetado como Proyecto No.: 202112-25; Informe No: IIRT/TOX/202112/ADT/0112; Fecha: 14-12-2021. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones del Comité para el Control y Supervisión de Experimentos con Animales (CPCSEA), Nueva Delhi, India. Los métodos implementados en el estudio actual están de acuerdo con las Directrices ARRIVE 2.067. En Materiales y métodos SI se menciona un protocolo que detalla los estudios de toxicidad dérmica aguda, los grupos de tratamiento y el diseño del experimento. El protocolo para el estudio de toxicidad dérmica fue de 14 días y los animales fueron sacrificados mediante sobredosis de isoflurano utilizando un sistema de anestesia para animales pequeños.

Se obtuvieron ratas (de cualquier sexo), con un peso de entre 250 y 300 g, del Centro de Casas para Animales Pequeños Libre de Enfermedades (DFSAH) de la Universidad de Veterinaria y Ciencias Animales Lala Lajpat Rai (LUVAS), Hisar, Haryana, India. Todos los métodos se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones del Comité para el Control y Supervisión de Experimentos con Animales (CPCSEA), Nueva Delhi, India. Los métodos implementados en el estudio actual están de acuerdo con las Directrices ARRIVE 2.067. Los animales fueron puestos en cuarentena y alojados en el Centro Central de Animales (Registro CPCSEA no. 1753 Wistar /PO/E/S/14/CPCSEA) para aclimatación durante siete días antes de la experimentación. Los animales de experimentación se dividieron en siete grupos (n = 6) y la duración del protocolo fue de 21 días. Después de 21 días, los animales fueron sacrificados mediante sobredosis de isoflurano utilizando un sistema de anestesia para animales pequeños. En Materiales y métodos SI se menciona un protocolo que detalla la inducción de lesiones por quemaduras de segundo grado, los grupos de tratamiento y el diseño del experimento.

Los animales fueron anestesiados y sacrificados por decapitación, y se recogieron y procesaron muestras de tejido de piel de acuerdo con los protocolos estándar. Las muestras utilizadas para la observación histológica se depositaron en formalina tamponada neutra al 10%. Los criterios farmacológicos constructivos, incluido el tiempo de epitelización y la contracción de la herida, han sido monitoreados mediante protocolos regulares68. La calidad de la piel curada por quemaduras, en comparación con un grupo normal, se evaluó utilizando una máquina de estiramiento de heridas, EFG500E, medidor de fuerza digital EFGE. Los estudios histológicos comenzaron inmediatamente el día 21, inmediatamente después de la inducción de la quemadura.

Después de la decapitación el día 21, se eliminó con cuidado todo el espesor de la piel curada y natural (1 cm2). El tejido se pesó y luego se homogeneizó con un homogeneizador de vidrio a 4 °C en 1 x PBS (peso del tejido (g): volumen de PBS (mL) = 1:9) y seguido de centrifugación a 10.000 g a 4 °C durante 30 min. . Los parámetros bioquímicos incluyen los niveles de malondialdehído (MDA)69, glutatión (GSH)70 y (catalasa) CAT71 de la muestra de piel homogeneizada, de acuerdo con protocolos estándar, que se analizaron utilizando un espectrofotómetro de doble haz UV/Visible (Shimadzu) y se expresaron en nmoles. MDA/ml, µmol/g de tejido y µmoles de peróxido de hidrógeno utilizados/mg/tejido/min, respectivamente.

El hidrolizado del tejido de la piel se preparó según el protocolo previamente mencionado del día 2172. Los contenidos de hidroxiprolina (HXP) y hexosamina (HXA) de los tejidos granulados se estimaron utilizando un espectrofotómetro de doble haz UV/Visible, Shimadzu, según los protocolos mencionados anteriormente y expresado en μg/mg de tejido.

El factor nuclear kappa B (NF-κB) de la muestra de piel homogeneizada se midió sobre la base de la teoría Sandwich-ELISA utilizando el paquete Rat NF-ŚB ELISA (Biolab Technology Laboratory, Shanghai Korian Biotech Co., Ltd). La muestra se preparó siguiendo el protocolo del operador y se midió a 450 nm en 10 minutos utilizando un lector de microplacas (Alere AM 2100).

Una rata de cada grupo fue sacrificada el día 21 después de la herida para su examen histopatológico. Se extirparon muestras de tejido (2 × 3 mm) colocadas en formalina tamponada (10%), deshidratadas con alcohol, y finalmente se insertaron en bloques de cera de parafina. Para la evaluación de modificaciones patológicas, se tiñeron trozos delgados de muestras de tejido (5 μm) con hematoxilina y eosina (H y E)73. Los portaobjetos teñidos se estudiaron con un microscopio Olympus CX41, Olympus Life Science Solutions, utilizando el software Magnus Pro Image Analysis. Se investigaron los portaobjetos para determinar congestión, degeneración y necrosis, neovascularización, proliferación y epitelización de fibroblastos, edema e infiltración de leucocitos. Todos los resultados estadísticos se analizaron utilizando un método ANOVA de dos factores seguido del análisis post hoc de Tukey con p ≤ 0,05 considerado significativo para todos los valores en GraphPad Prism 8.4.3.686.

El protocolo de investigación para la toxicidad dérmica aguda del hidrogel adhesivo a base de gelatina bioinspirado en ratas albinas Wistar según las directrices reglamentarias de la "OCDE 402" para pruebas de productos químicos se llevó a cabo en el Instituto de Investigación y Toxicología Industrial, Ghaziabad, India, Proyecto No. .: 202112-25; Informe No.: IIRT/TOX/202112/ADT/0112.

El protocolo de investigación para la curación de heridas por quemaduras de segundo grado fue aprobado por el Comité Institucional de Ética Animal (IAEC) de la Facultad de Farmacia Khalsa, Amritsar, Punjab. vide aprobación no. AICE/KCP/2020/008.

Suchithra TV, Benu G, Hidrogel adhesivo a base de gelatina como parche para heridas para diversas superficies. (Solicitud No: 202041044794, Oficina de Patentes del Gobierno de la India, Estado: Presentada).

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

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Descargar referencias

Nos gustaría agradecer a Animal House Facility, Khalsa College of Pharmacy, Amritsar, India, que nos abrió sus puertas para un estudio colaborativo con la Escuela de Biotecnología, Instituto Nacional de Tecnología de Calicut, Kozhikode, India. Un agradecimiento especial al Dr. Madhukar Saxena, Universidad Babasaheb Bhimrao Ambedkar de Lucknow, por todo el apoyo durante la etapa final. También nos gustaría agradecer a la Dra. Anugya Bhatt y su equipo por permitirnos realizar la optimización de la toxicidad del hidrogel.

Escuela de Biotecnología, Instituto Nacional de Tecnología de Calicut, Kozhikode, India

Benu George y Suchithra TV

Departamento de Farmacología, Facultad de Farmacia Khalsa, Amritsar, Punjab, India

Nitish Bhatia y Abhitinder Kumar

Facultad de Ciencias Médicas y Afines, Universidad GD Goenka, Haryana, India

nitish bhatia

CSIR-Instituto Central de Investigación del Cuero, Adyar, Chennai, India

Gnanamani A., Thilagam R. y Shanuja SK

División de Bioquímica y Biología Molecular, Departamento de Zoología, Universidad de Calicut, Kozhikode, India

Kannan Vadakkadath Meethal y Shiji TM

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BG: Conceptualización, Validación, Metodología, Investigación, Análisis formal, Escritura—borrador original; STV: Metodología, Validación, Supervisión, Redacción: revisión y edición; NB y AK: Metodología, Recursos, Análisis formal, Edición; GRT y SKS: Recursos, Edición; KVM y STM: Metodología, Recursos, Edición.

Correspondencia a Suchithra TV.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

George, B., Bhatia, N., Kumar, A. et al. Hidrogel adhesivo a base de gelatina bioinspirado para diversas superficies en el cuidado de heridas por quemaduras. Informe científico 12, 13735 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-17054-w

Descargar cita

Recibido: 12 de abril de 2022

Aceptado: 20 de julio de 2022

Publicado: 12 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-17054-w

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