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May 24, 2024

Efectos de los hongos endófitos sobre el proceso parasitario de Taxillus chinensis

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 7744 (2022) Cita este artículo 1514 Accesos 1 Citas 1 Detalles de métricas Altmetric Taxillus chinensis (DC.) Danser es un arbusto medicinal ampliamente utilizado

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 7744 (2022) Citar este artículo

1514 Accesos

1 Citas

1 altmétrica

Detalles de métricas

Taxillus chinensis (DC.) Danser es un arbusto medicinal ampliamente utilizado en los sistemas de medicina tradicionales y modernos. Es una planta hemiparásita perenne, de difícil propagación artificial debido a su baja tasa parasitaria. El parasitismo exitoso de las plantas parásitas consiste en fusionar sus tejidos y conectar su vasculatura a la vasculatura del huésped construyendo un puente fisiológico, que pueda extraer eficientemente agua, azúcares y nutrientes de sus plantas huéspedes. Se informa que los hongos endofíticos desempeñan un papel importante en la degradación y fusión de la pared celular, que es el proceso clave de formación del puente fisiológico. Por lo tanto, en este estudio se aislaron los hongos endófitos de T. chinensis de diferentes hospedantes, y luego se seleccionaron los organismos que pudieran degradar los principales componentes de las paredes celulares utilizando un medio compuesto por guaihuol y capacidad de degradación de celulosa. Los resultados mostraron que se seleccionaron cinco cepas de 72 hongos endófitos de T. chinensis con altas actividades enzimáticas para la degradación lignocelulósica. Las actividades lacasa y celulasa de cinco cepas alcanzaron su punto máximo el día 7, y las actividades enzimáticas más altas de estas dos enzimas se encontraron en la cepa P6, que fue de 117,66 y 1,66 U/mL, respectivamente. La manganeso peroxidasa de la cepa 4 y la lignina peroxidasa de la cepa N6 también alcanzaron sus picos el día 7 y fueron las más altas entre las 5 cepas, con actividades enzimáticas de 11,61 y 6,64 U/mL, respectivamente. Las cepas 4, 15, 31, N6 y P6 fueron identificadas como Colletotrichum sp., Nigerrospora sphaerica, Exserohilum sp., Diaporthe Phaseolorum y Pestalotiopsis sp., respectivamente, según sus propiedades morfológicas y de biología molecular. Los hongos endofíticos pueden secretar enzimas eficientes de degradación de la pared celular, que promueven la disolución y relajación de la pared celular entre T. chinensis y el huésped, contribuyendo así al parasitismo de T. chinensis.

Taxillus chinensis (DC.) Danser perteneciente a la familia Loranthaceae se distribuye principalmente en las zonas sur y suroeste de China. Los tallos y ramas secos con hojas de T. chinensis son ingredientes comúnmente utilizados en la medicina tradicional china y se llaman "Sang Ji Sheng" en China. T. chinensis tiene un alto valor medicinal. Se utiliza para el alivio de afecciones reumáticas, refuerzo del hígado y riñones, fortalecimiento de tendones y huesos y prevención de abortos1. T. chinensis es una planta hemiparásita con diversos huéspedes2. Mientras tanto, T. chinensis también se utiliza como materia prima para preparar té contra el parasitismo en China, que es un té tradicional chino para el cuidado de la salud y se exporta a casi 30 países del sudeste asiático3. Por lo tanto, la demanda de T. chinensis aumenta constantemente en el mercado herbario mundial debido a su inmenso potencial terapéutico. Sin embargo, T. chinensis se deriva principalmente de recursos silvestres, que no pueden satisfacer plenamente la creciente demanda del mercado. El cultivo artificial de T. chinensis es una medida eficaz para equilibrar la oferta y la demanda del mercado.

Sin embargo, T. chinensis es una planta hemiparásita perenne, que es difícil de propagar artificialmente debido a su baja tasa de parásitos. Un componente esencial del éxito parasitario en las plantas parásitas es la capacidad de fusionar las paredes de sus células huésped y conectar su vasculatura mediante un órgano especializado conocido como haustorio, formando así un puente fisiológico4,5,6,7. Esto permite la transferencia no solo de agua y nutrientes al parásito sino también de macromoléculas, incluidos ARNm8 y proteínas9. Por tanto, la pared celular del huésped es la primera barrera para la formación de un puente fisiológico. Curiosamente, los estudios han encontrado que la penetración del haustorio no causa daños significativos a las células de la planta huésped. Por ejemplo, el haustorio de Striga hermonthica no causa daño a las células de la endodermis de la planta huésped durante la penetración10,11,12. Esto se puede lograr de diferentes maneras. En la mayoría de las plantas parásitas de la familia Orobanchaceae se ha encontrado en el proceso parasitario una gran cantidad de enzimas relacionadas con la degradación de la pared celular12,13. Por ejemplo, la pectina metil esterasa, que puede degradar la pectina, se encuentra en los sitios de punción del hastorium de Oroanche cumana Wallr. y Phelipanche aegyptiaca Pers.14. Se ha demostrado que otros modificadores de la pared celular, como las dilatasas y las enzimas con actividad transglucanasa, alcanzan su punto máximo durante el período de penetración de la infección por WM-xilglucano. Por el contrario, la inhibición de estos modificadores de WM-xilglucano redujo la posibilidad de una invasión exitosa de la cuscuta15. Por tanto, las enzimas relacionadas con la degradación de la pared celular juegan un papel importante durante el proceso parasitario. Sin embargo, el origen de estas enzimas no se ha explorado más a fondo.

T. chinensis es una planta hemiparásita con diversos huéspedes2, nuestros trabajos anteriores encontraron que T. chinensis de diferentes huéspedes tenía ricos recursos de hongos endófitos. Se ha informado que los hongos endofíticos juegan un papel importante en las estrategias de infección y colonización de las plantas hospedantes. Muchos estudios también han demostrado que los hongos endófitos tienen una gran capacidad para producir enzimas relacionadas con la degradación de la pared celular16,17. Por ejemplo, los hongos endófitos que se ha informado que son productores de xilanasa incluyen Alternaria alternata18, Hymenoscyphus ericae19 y Aspergillus terreus20. De Almeida et al.21 seleccionaron cepas de la especie endófita Acremonium para la producción de hemicelulasas y celulasas. Suto et al.22 aislaron 155 cepas de hongos productores de xilanasas. Harnpicharnchai et al.23 purificaron una β-glucosidasa termotolerante de una Periconia sp. de 14 especies de plantas. Robl et al.16 aislaron 110 cepas de hongos endófitos que producían hemicelulasas y enzimas relacionadas. Otros estudios han implicado la selección de nuevos aislados utilizando enzimas extracelulares como parámetros de selección para la promoción del crecimiento de las plantas. Por ejemplo, Silva et al.24 investigaron hongos aislados de Annona spp., mientras que Luz et al.25 emplearon aislados de Passiflora edulis. El estudio de Queiroz et al.26 encontró que respecto a las CAZimas en los secretomas de los hongos analizados, las familias de CAZimas más abundantes eran la glicosil hidrolasa y las serina proteasas. Y este estudio demuestra que los secretomas de hongos endofíticos y no endófitos comparten un arsenal de proteínas importantes en el proceso de infección y colonización de plantas hospedantes. Además, Jaklitsch et al.27 realizaron un análisis filogenético de las enzimas activas sobre los carbohidratos que degradan la pared celular de las plantas y las proteínas auxiliares codificadas en los genomas de nueve especies de Trichoderma que son miembros de tres clados infragenéricos principales además de otros doce hongos Hypocreales. Druzhinina et al.28 investigaron la evolución de las proteínas necesarias para la degradación de la pared celular vegetal en nueve genomas de Trichoderma y encontraron un número sin precedentes de eventos de transferencia lateral de genes (LGT) para genes que codifican estas enzimas.

Es bien sabido que los principales componentes de las paredes celulares vegetales son la lignina y la celulosa. El papel de los hongos en la degradación de estas sustancias ha sido ampliamente reportado, pero estos informes se han centrado principalmente en algunos tipos de hongos que pudren la madera, como el hongo de la pudrición blanca Phanerochaete chrysosporium Burds, Ceriporiopsis subvermispora (Pila T) Gilb. & Ryvarden, y el hongo de la pudrición parda Postia placenta (Fr.) MJ Larsen & Lombard, etc29,30,31. Los hongos de pudrición blanca se consideran los más eficaces y son los principales microorganismos para la degradación de la lignina. Los hongos de pudrición blanca han formado un sistema de degradación único en el proceso de evolución biológica a largo plazo. La lacasa, la manganeso peroxidasa y la lignina peroxidasa constituyen conjuntamente el sistema enzimático de degradación de la lignina de los hongos de pudrición blanca32, y pueden degradar todos los componentes de las paredes celulares de las plantas, incluidas la lignina, la celulosa y las hemicelulosas33,34.

Actualmente, se sabe poco sobre el mecanismo de los hongos endófitos en la degradación de la pared celular de las plantas, pero el papel de los hongos de la pudrición de la madera en la degradación de la lignina proporciona una referencia para estudiar el mecanismo parasitario de T. chinensis desde la perspectiva de los hongos endófitos. Este método demostró que las cepas de hongos de pudrición blanca tenían la mayor capacidad de degradación de lignina y celulosa35,36,37. En el presente estudio, aislamos hongos endófitos de raíces haustoriales de diferentes huéspedes, estas cepas fueron seleccionadas para la determinación cualitativa de las actividades enzimáticas de lacasa, lignina peroxidasa, manganeso peroxidasa y celulasa. Explorar el mecanismo de los hongos endófitos de T. chinensis en la degradación de la pared celular durante el proceso parasitario no sólo proporciona orientación práctica y base teórica para la propagación de T. chinensis, sino que también puede proporcionar nuevas ideas de investigación sobre los mecanismos parasitarios de otros plantas parásitas, como Cuscuta chinensis, Striga asiatica, Cistanche deserticola.

Se aislaron un total de 147 cepas de T. chinensis (DC.) Danser compuestas por siete especies hospedadoras. Se trataba de 32 cepas de Morus alba L., 17 cepas de Prunus salicina Lindl., 12 cepas de Diospyros kaki Thunb., 26 cepas de Dimocarpus longan Lour., 10 cepas de Phellodendron chinense Schneid., 27 cepas de Dalbergia odorifera T.Chen y 23 cepas de Bauhinia purpurea Linn.. Se seleccionaron un total de 72 cepas con diferentes tipos morfológicos y se evaluaron las actividades de la enzima degradadora de lignina y la celulasa mediante el uso de las placas.

Los microorganismos que produjeron el círculo cromogénico en el medio selectivo con guaiacol como indicador tuvieron la capacidad de degradar la lignina, y las hifas de las cepas productoras de lacasa que crecieron en el medio produjeron una coloración marrón rojiza evidente. Se cultivaron 72 cepas en placas de medio selectivo de guayacol durante 11 días, y se observó y registró la decoloración de cada placa los días 3, 5, 7, 9 y 11. Los resultados mostraron que 11 cepas no tenían círculo de colonias ni círculos cromogénicos. 17 cepas tenían una relación entre el diámetro del círculo de la colonia y el diámetro del círculo cromogénico menor que 1. Hubo 26 cepas con una relación entre el diámetro de la colonia y el diámetro del cromógrafo mayor que 1. Hubo 7 cepas con círculos cromogénicos pero sin círculos de colonia. Se encontraron 11 cepas con colonias pero sin círculos cromogénicos. Según la referencia38, la investigación muestra que la relación entre el diámetro del círculo de la colonia y el cromóforo se puede utilizar para juzgar si las bacterias pueden degradar selectivamente la lignina. Si la proporción es inferior a 1, las bacterias pueden degradar selectivamente la lignina. En resumen, después de una selección preliminar cualitativa y una nueva selección mediante el método del guayacol, se seleccionaron un total de 5 cepas con círculos cromogénicos grandes y obvios de 24 cepas de hongos (cepas de hongos con una relación entre el diámetro del círculo de la colonia y el diámetro del círculo cromogénico de menos de 1 y cepas con círculos cromogénicos pero sin colonias) para posteriores pruebas de actividad enzimática (Tabla 1). Se puede ver en la Tabla 1 que las colonias y los círculos cromogénicos de estas 5 plantas también aumentaron con el período de crecimiento, y ninguno de ellos aumentó hasta el día 11. La Figura 1 muestra el crecimiento de las cinco cepas en la placa de color PDA después del día. 7.

Diagramas de crecimiento de diferentes cepas en la placa de color de PDA al séptimo día. Nota: 4 representa Colletotrichum acutatum; 15 representa Nigrospora sphaerica; 31 representa Exserohilum rostratum; N6 representa Diaporthe Phaseolorum; P6 representa Pestalotiopsis arceuthobii.

Con respecto al cultivo en placa de medio sólido de celulosa de 72 cepas el día 11, la inspección de las placas en los días 3, 5, 7, 9 y 11 mostró que 14 cepas no tenían círculos de colonia transparentes. La relación entre el diámetro de la colonia y el diámetro del círculo transparente fue inferior a 1 en 58 cepas. Las otras cepas tenían una relación entre el diámetro libre de la colonia y el diámetro transparente superior a 1. De manera similar, se seleccionaron cepas con la misma enzima degradante de lignina de cepas con una relación entre el diámetro del círculo de la colonia y el diámetro del círculo transparente inferior a 1 para la posterior prueba de actividad enzimática. (Tabla 2). Como puede verse en la Tabla 2, estas 5 cepas crecieron gradualmente con el tiempo y permanecieron sin cambios hasta los 9 días, manteniendo el rango de valores original. La Figura 2 muestra el crecimiento cromogénico de estas cinco cepas en medio sólido de celulosa el día 7.

Diagramas de crecimiento de diferentes cepas en las placas de agar rojo Congo el día 7. Nota: 4, 15, 31, N6 y P6 representan Colletotrichum acutatum, Nigrospora sphaerica, Exserohilum rostratum, Diaporthe Phaseolorum y Pestalotiopsis arceuthobii, respectivamente.

Se construyó un árbol filogenético combinando secuencias de ADNr ITS y secuencias de beta-tubulina, y los resultados (Fig. 3) mostraron que las tinciones 4, 15, 31, N6 y P6 se ​​correlacionaban con Colletotrichum sp., Nigrospora sphaerica (CBS MH854879), Exserohilum sp., Diaporthe Phaseolorum (CBS KC343176) y Pestalotiopsis sp. Estas especies están en la misma rama y la similitud es del 99 al 100%. Por lo tanto, estas cinco cepas fueron identificadas como Colletotrichum sp., N. sphaerica, Exserohilum sp., D. Phaseolorum y Pestalotiopsis sp., respectivamente. En la Fig. 3 se muestra un árbol filogenético de cinco aislados de este estudio y secuencias de GenBank que utilizan genes ITS y TUB2 combinados con análisis del método Neighbor-Joining. El porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba de arranque (1000 réplicas) se muestra encima de las ramas. El árbol está dibujado a escala, con longitudes de ramas en las mismas unidades que las de las distancias evolutivas utilizadas para inferir el árbol filogenético. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de distancia p y están en las unidades del número de diferencias de bases por sitio. Todos los taxones se distribuyeron en cinco grupos, a saber, el filo Ascomycota dentro de cinco órdenes y cinco géneros. La cepa P6 compuso un clado soportado, que cerró con la cepa 15. Las cepas N6 y 4 componían un clado soportado (98% de soporte de arranque), que cerró con las cepas P6 y 15. Las secuencias de estas cinco cepas se enviaron a la base de datos GenBank y la accesión los números obtenidos (ITS y beta-tubulina) son MZ2823601/MZ964759, MZ2823600/MZ934421, MZ2823597/MZ934418, MZ2823599/MZ934420 y MZ2823598/MZ934419, respectivamente.

Árbol filogenético construido a partir de secuencias de ITS rDNA y beta-tubulina. Los valores de Bootstrap > 50% (1000 replicaciones) se proporcionan en los nodos. Se utilizó Gaertneriomyces semiglobiferus como grupo externo.

Como se puede ver en la Fig. 4A, el momento máximo de producción de lacasa de estas cinco cepas fue el día 7, y comenzó a disminuir a partir del día 9. La capacidad de producción de lacasa de las 5 cepas fue significativa (P <0,05). Entre ellos, Pestalotiopsis sp. tuvo la mayor capacidad de producción de lacasa (117,66 U/mL), seguida de D. Phaseolorum, N. sphaerica y Exserohilum sp. (51,82, 32,11 y 21,85 U/mL, respectivamente), y Colletotrichum sp. tuvo la actividad de producción de lacasa más débil (9,76 U/mL). El orden de actividad enzimática de las cinco cepas fue Pestalotiopsis sp. > D. Phaseolorum > N. sphaerica > Exserohilum sp. > Colletotrichum sp.

Variaciones de actividades enzimáticas relevantes producidas por diferentes hongos endófitos a lo largo del tiempo durante la degradación de lignina y celulosa: (A) actividad de lacasa; (B) actividad de manganeso peroxidasa; (C) actividad de lignina oxidasa; (D) actividad celulasa.

Como se muestra en la Fig. 4B, el valor más alto de producción de peroxidasa de manganeso por Colletotrichum sp. fue de 7 días, con la actividad enzimática de 11,61 U/mL, seguida de D. faseolorum y Exserohilum sp., con las mayores actividades enzimáticas de 8,47 y 5,58 U/mL, respectivamente. Por otra parte, N. sphaerica y Pestalotiopsis sp. tuvo la mayor capacidad de producción de enzimas el día 11, y las actividades enzimáticas fueron 8,59 y 6,79 U/mL, respectivamente.

Como se muestra en la Fig. 4C, las curvas de actividad de la lignina peroxidasa de D. faseolorum, Colletotrichum sp., Exserohilum sp. Todos aumentaron primero con el cambio de tiempo, alcanzaron el pico de actividad enzimática y luego comenzaron a disminuir. La mayor capacidad de producción de lignina peroxidasa de estas tres cepas fue a los 7 días, y las actividades enzimáticas fueron 6,64, 3,0 y 2,9 U/mL, respectivamente. Las actividades de lignina peroxidasa de Pestalotiopsis sp. y N. sphaerica aumentaron al principio, luego disminuyeron y luego comenzaron a aumentar nuevamente el día 11, con las actividades enzimáticas más altas de 4,21 y 3,4 U/mL, respectivamente. El orden de actividad de la lignina peroxidasa de las cinco cepas fue D. Phaseolorum > Pestalotiopsis sp. > N. sphaerica > Colletotrichum sp. > Exserohilum sp., y los valores de las actividades enzimáticas en los valores más bajos y más altos de las cinco cepas fueron significativamente diferentes (P <0,05).

En la Fig. 4D, se puede ver que las actividades de la enzima celulosa de las cuatro cepas, Pestalotiopsis sp., D. Phaseolorum, Exserohilum sp. y Colletotrichum sp. primero aumenta hasta alcanzar un pico en el día 5 y luego disminuye. Sin embargo, para N. sphaerica se observa una caída repentina el día 5 y luego un aumento el día 7 seguido de una disminución. En las cinco cepas, la producción de celulasa en el día 7 fue máxima. Las actividades de celulasa fueron 1,66, 1,11, 0,67, 0,61 y 0,59 U/mL el día 7 en Pestalotiopsis sp., D. Phaseolorum, Exserohilum sp., Colletotrichum sp. y N. sphaerica, respectivamente.

Como se puede ver en la Tabla 3, se realizó una pulverización diaria del líquido de fermentación en las cepas con enzimas de alta degradación de la pared celular, y se encontró que las tasas de parasitismo de estas tres cepas mejoraron en diversos grados, entre las cuales se encontraba la cepa de P. arceuthobii. tuvo la mejor tasa de parasitismo, alcanzando el 17%, significativamente mayor que el control. Las enzimas que degradan la pared celular producidas por hongos endofíticos contribuyen al parasitismo de T. chinensis.

Las enzimas relacionadas con la degradación de la pared celular juegan un papel importante en el proceso y los hongos endófitos son una de las fuentes de estas enzimas. Por lo tanto, en este estudio, se seleccionaron cinco hongos endofíticos con altas enzimas de degradación de la pared celular a partir de 147 hongos endofíticos de ramas de Taxillus chinensis de diferentes huéspedes. Las cinco cepas endófitas fueron Colletotrichum sp., Nigerrospora sphaerica, Exserohilum sp., Diaporthe Phaseolorum y Pestalotiopsis sp., respectivamente. Al mismo tiempo, también aislamos 47 hongos endófitos de diferentes ramas del huésped (Tabla complementaria 1). Además de Morus alba, se secuenciaron hongos endófitos de las otras seis ramas hospedantes y se destruyeron en GenBank para identificar Colletotrichum sp., Nigerrospora sp., Diaporthe sp. y Pestalotiopsis sp. Sin embargo, se necesita más investigación para determinar si estos hongos también pueden producir estas enzimas que degradan la pared celular y si pueden promover el parasitismo de T. chinensis. Existen muchos tipos de enzimas que degradan la pared celular. En este estudio, se midieron cuatro tipos de enzimas que degradan la pared celular, incluidas la lignina peroxidasa, la manganeso peroxidasa y la lacasa y la celulosa. Intentamos utilizar estos hongos endófitos con una alta producción de cuatro enzimas para realizar el cultivo en caldo de fermentación y seleccionamos el caldo de fermentación de la cepa con alta actividad enzimática para rociar semillas de T. chinensis en las ramas de Morus alba todos los días y calcular la tasa de parásitos de la morera. , 5% más que el control (esta parte del experimento sigue siendo verificación repetida y estadísticas). Además de estas enzimas, el análisis de datos de RNA-seq publicados previamente mostró que ciertos genes que codifican xiloglucano endoglucasa/hidrolasas y pectina metilesterasas, poligalacturonasas y enzimas similares a celulasas en Cuscuta campestris6,7,15,39,40. Los estudios han demostrado que la endoglicosilación del xiloglucano es más evidente en la pared celular de la región de agrandamiento haustorial hacia la planta huésped, pero también puede detectarse en las últimas etapas del desarrollo haustorial39. Estos datos confirman que la invasión haustorial de las especies de Cuscuta se ve facilitada no sólo por la acción mecánica sino también por la degradación bioquímica específica y la modificación de la pared celular del huésped3,40. Estos investigadores sugieren que las enzimas involucradas en la degradación y modificación de la remodelación de las paredes celulares del huésped en Cuscuta XTH preparan al parásito para la infección del huésped y pueden contribuir al crecimiento invasivo de haustrales39. Por lo tanto, es necesario realizar una verificación experimental adicional para saber si estas enzimas también existen en el hongo dominante aislado de diferentes huéspedes y T. chinensis, y si estas enzimas pueden promover el parasitismo del haustorio en el huésped.

En este estudio, se seleccionó salvado de trigo como sustrato de biomasa de fibra de lignina para la fermentación y se determinaron las actividades de lacasa, manganeso peroxidasa, lignina peroxidasa y celulasa en diferentes momentos. Se encontró que el tiempo máximo de actividad de las cinco cepas productoras de lacasa y celulasa fue de 7 días, y las mayores actividades de lacasa y celulasa se encontraron en la cepa P6, las cuales fueron 117,66 y 1,66 U/mL, respectivamente. Pestalotiopsis sp. fue identificada por sus características morfológicas y de biología molecular. Se ha informado que Pestalotiopsis sp. El hongo puede producir actividades de lacasa y celulosa relativamente altas y puede degradar eficazmente la basura forestal41. Además, se encontró que el color de los extractos del caldo de fermentación de Pestalotiopsis sp. era significativamente más ligero que el de las otras cuatro cepas. Esto se debe a que la lacasa se puede utilizar para la decoloración y degradación del combustible y potencialmente se puede utilizar contra estrategias de calentamiento global42,43. Pestalotiopsis sp. produjo la actividad lacasa más alta de 117,66 U/mL, que fue un valor relativamente alto en comparación con las actividades enzimáticas crudas no purificadas reportadas actualmente, y su producción no dependió de la adición de algunos factores inducibles como la temperatura del suelo de 80 °C, ácido ferúlico, Cu2+ o dimetilanilina. Además, Cao et al.44 informaron que la actividad enzimática de la lacasa con la adición de una temperatura del suelo de 80 °C y un inductor de Cu2+ era de hecho mucho mayor dentro de una semana de crecimiento. Sin embargo, a excepción del hongo de pudrición blanca, Ganoderma applanatum, el valor promedio de la actividad de lacasa de otros dos hongos de pudrición blanca (Trametes hirsuta y Fomes fomentarius) no alcanzó sus valores máximos. Estos resultados indican que Pestalotiopsis sp. es una cepa productora de lacasas relativamente eficaz.

Las actividades máximas de las peroxidasas de manganeso y lignina de D. Phaseolorum, Colletotrichum sp., N. sphaerica y Exserohilum sp. también apareció el día 7, pero el segundo pico de actividades de manganeso peroxidasa de la cepa N. sphaerica y Pestalotiopsis sp. el día 11 fueron 8,59 y 6,79 U/mL, respectivamente. Las actividades enzimáticas de la lignina peroxidasa fueron 3,4 y 4,21 U/mL, respectivamente, lo que concordó con los informes sobre lignasa y celulasa de algunos hongos de pudrición blanca45,46,47. El segundo pico puede deberse a la liberación de las correspondientes enzimas intracelulares que originalmente estaban unidas a las membranas celulares debido a la autólisis de las hifas41. Las cuatro cepas de N6, 4, 15 y 31 fueron identificadas por sus características morfológicas y de biología molecular como D. faseolorum, Colletotrichum sp., N. sphaerica, Exserohilum sp., respectivamente. Este es el primer informe de cuatro hongos que producen enzimas que degradan la lignocelulosa utilizando biomasa fibrosa de gluten de trigo como sustrato. Algunos estudios previos también han investigado las actividades de lacasa, lignina peroxidasa, manganeso peroxidasa y celulasa producidas por hongos de seis hongos menos comunes (Alternaria sp., Penicillium sp., Cephalosporium sp., Tricherderma sp., Pestalotiopsis sp. y Aspergillus fumigates). durante la degradación de la hojarasca del pino Masson41.

La degradación de la lignina y la celulosa no depende de una única enzima, sino que es el resultado de las interacciones de varias enzimas. Las enzimas de degradación de la lignina constan principalmente de tres enzimas: lignina peroxidasa, manganeso peroxidasa y lacasa48. Además, el tamaño del círculo cromático está necesariamente relacionado con el nivel de actividad de lacasa, pero no existe una correlación lineal positiva entre estos dos parámetros49. Las enzimas que degradan la celulosa consisten principalmente en una endoglucanasa, una exoglucanasa y una β-glucosidasa, y la acción sinérgica de estas tres enzimas es necesaria para la hidrólisis completa de la celulosa en monosacáridos50,51,52.

En enero de 2020, se recolectaron en la base de plantación de T. chinensis raíces de T. chinensis de diferentes hospedantes, incluidos M. alba, P. salicina, P. chinense, D. odorifera, B. purpurea, D. kaki y D. longann. de Cenxi Funing Village, ciudad de Wuzhou (111° 51′ 14″ E, 22° 58′ 12″ N). Recolectamos de 3 a 5 haustorios de T. chinensis de las mismas plantas hospedantes.

El salvado de trigo se compró a Zhonghe Modern Agriculture Development Group Co. Ltd. El pretratamiento del salvado de trigo se basó en el método de Tao Yanjuan53 con algunas modificaciones. El salvado de trigo se trituró a través de un tamiz de malla 40, luego se añadió 10 veces el volumen de agua destilada y la mezcla se trituró usando un molino coloidal durante 25 minutos. Las impurezas líquidas se filtraron con un tamiz de malla 150 y las partes sólidas se secaron en una estufa a 60 °C durante 24 h y luego se trituraron. Se añadió diez veces el volumen de agua destilada y se calentó a 95 °C durante 30 min. Se usó ácido clorhídrico 1 M para ajustar el pH a 5,6 y se añadió α-amilasa resistente a altas temperaturas al 1,5 % (p/p). La reacción se agitó a 95 °C durante 30 min y la reacción completa se detectó con una solución de yodo. La temperatura se redujo a 50 °C y el pH se ajustó a 9,0 con NaOH al 3 % (p/p), se añadió proteasa alcalina y la reacción se agitó durante 2 h, luego se descartó el sobrenadante, se filtró y se enjuagó a través de un 150 -tamiz de malla en agua clara hasta que se redujo la turbidez de la solución lavada, y las sustancias sólidas restantes se secaron en un horno a 60 °C durante 24 h. El salvado de trigo se obtuvo mediante secado y se trituró mediante un microtriturador, se tamizó con malla 100, se secó en estufa a temperatura constante a 50 °C durante la noche y luego se almacenó. El objetivo del pretratamiento es eliminar el almidón y las proteínas del salvado de trigo. De esta forma, el componente principal de la fibra dietética del salvado de trigo es la fibra dietética insoluble.

El medio PDA consistió en 200 g/L de patata, 20 g/L de glucosa y 20 g/L de agar. El pH fue 7,0 y se esterilizó a 1 x 105 Pa durante 30 min. El medio líquido de semilla consistió en 20 g/L de glucosa, 2 g/L de extracto de levadura, 3 g/L de KH2PO4, 1,5 g/L de MgSO4 · 7H2O y 0,5 g/L de VB1. El pH fue neutro y se esterilizó a 1 × 105 Pa durante 30 min. El medio sólido con guayacol estuvo compuesto por 200 g/L de papa, 20 g/L de glucosa, 20 g/L de agar, 3 g/L de KH2PO4, 1,5 g/L de MgSO4·7H2O, 0,02 g/L de VB1 y 1 g/L de guayacol. El pH fue neutro y se esterilizó a 1 × 105 Pa durante 30 min. El medio básico para la fermentación líquida consistió en 30 g/L de salvado de trigo, 3 g/L de KH2PO4, 1,5 g/L de MgSO4·7H2O, 1,4 g/L de (NH4)2SO4, 0,3 g/L de CaCl2, 5 mg/L de FeSO4·. 7H2O, 1,6 mg/L, MnSO4·H2O y 0,02 g/L VB1. El pH fue neutro y se dividió en matraces triangulares de 250 mL, o 100 mL por frasco y se esterilizó a 1 × 105 Pa durante 30 min. El medio sólido de celulosa54 consistía en 5 g/L de carboximetilcelulosa sódica, 0,5 g/L de extracto de levadura, 0,5 g/L de peptona, 0,3 g/L, extracto de carne, 3 g/L, KH2PO4, 5 g/L de K2HPO4, 2 g. /L, (NH4)2SO4, 0,4 g/L de MgSO4, 0,1 g/L de CaCl2, 1 ml de una solución de oligoelementos, 20 g/L de agar en polvo y 0,5 g de rojo Congo en polvo disueltos en 50 ml de agua esterilizada. La solución de oligoelementos consistía en 0,07 g/L de ZnCl2, 0,1 g/L de MnCl2·4H2O, 0,06 g/L de H3BO3, 0,2 g/L de CoCl2·6H2O, 0,02 g/LCuCl2·2H2O, 0,02 g/L de NiCl2·6H2O, 0,04 g/L NaMoO4·2H2O, y 1 ml/L ácido clorhídrico.

Se seleccionaron haustorios sanos y libres de enfermedades de T. chinensis de diferentes huéspedes y los tejidos se cortaron en fragmentos de 5 cm. Estas muestras se lavaron con agua del grifo y se secaron de forma natural. Las superficies se desinfectaron sucesivamente con etanol al 75% y HgCl2 al 0,1% durante 2,5 min y se lavaron con agua esterilizada tres veces55. Utilizando pinzas y bisturís estériles, se cortaron en bloques de tejido de aproximadamente 5 mm de tamaño y luego se colocaron en placas PDA (medio que contiene estreptomicina) con 5 bloques por placa y 3 placas por muestra. Los cultivos se mantuvieron a 28 °C hasta que el micelio creció desde el borde de los bloques de tejido, y luego estos se transfirieron a placas PDA para su purificación y conservación.

Se añadió medio PDA de guayacol al 0,1% para la detección inicial de enzimas que degradan la lignina56. Luego de la purificación, se seleccionaron bloques de fuangal con un diámetro de 6 mm y se colocaron en las placas sobre una plataforma súper limpia, con 3 réplicas para cada cepa, y estas se cultivaron a 28 °C durante 10 días. Se observaron y analizaron estadísticamente los diámetros de las colonias y los círculos de color dentro de la placa, así como cualquier cambio en el color de las colonias.

La selección primaria de cepas de enzimas celulolíticas se llevó a cabo mediante el siguiente método. Los bloques de tejido (6 mm de diámetro) de las cepas purificadas se inocularon en el medio de cultivo junto con medio sólido de celulosa. Para cada grupo esto se repitió 3 veces y luego se incubó a 28 °C durante 10 días. Las células se tiñeron con rojo Congo al 0,1% durante 15 minutos y luego se decoloraron con NaCl 1 M durante 15 minutos. Diámetro del círculo transparente unitario = diámetro del círculo transparente - diámetro de la colonia. Se consideró que cuanto mayor era el diámetro del círculo transparente, mayor era la actividad de producción de enzimas54.

Las cepas de enzimas que degradan la lignina celulosa con anillos cromogénicos y transparentes se seleccionaron de acuerdo con el método anterior.

Las cepas que degradan la lignocelulosa con anillos cromogénicos y transparentes se seleccionaron para cultivos de 5 a 7 días, y se inocularon cuantitativamente respectivamente. Se agregaron 10 ml del líquido de semilla agitado a un matraz triangular de 250 ml que contenía 100 ml de medio de fermentación líquido. Cada cepa se inoculó en 2 frascos, y en el mismo frasco se colocaron 5 bloques de cepas de 6 mm de diámetro. Estos se incubaron durante 11 días en un agitador a temperatura constante a 26 °C y 140 r/min. Se tomaron muestras a partir del cuarto día de cultivo líquido, una vez al día. El líquido de fermentación se filtró con cuatro capas de gasa y el filtrado se centrifugó a 3000 r/min durante 15 min. Los sobrenadantes eran el líquido enzimático bruto.

La morfología de la colonia se registró haciendo referencia al método de Fang Zhongda52, y este parámetro se identificó inicialmente haciendo referencia al método de Wei Jingchao57. Su ADNr (ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′ e ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) y beta-tubulina (βT-2a) 5′-AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3′ y beta-tubulina (βT-2b) 5′-ACCTCAGTGTAGTGACCTTGGC -3′) se utilizaron para la identificación biológica molecular58,59. Se utilizó el kit Mightyamp DNA Polymerase Ver.3 (1,25 U/50 μL) (Takara Bio Inc., Japón, Cat. No. R076A) para seleccionar hifas de hongos endofíticos como plantillas para la reacción de PCR. Todas las reacciones de PCR se realizaron en volúmenes de 50 uL que contenían 1x tampón de PCR, concentraciones de 0,2 mM de cada dNTP, MgCl2 4 mM, concentraciones de 0,5 uM de cada cebador, 0,5 unidades de ADN polimerasa Taq (Takara) y 1 uL de tem. -placa de ADN (20 ng/uL). El programa de PCR para TUB2 incluyó un paso de desnaturalización a 94 °C durante 2 min, seguido de 35 ciclos a 94 °C durante 45 s, 60 °C durante 45 s y 72 °C durante 1 min, y un ciclo final a 72 °C. ºC durante 10 min. El programa de PCR para la región ITS incluyó un paso de desnaturalización de 2 min a 94 °C seguido de 34 ciclos a 94 °C durante 1 min, 55 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min, y un ciclo final de 10 minutos a 72°C. Las bandas diana se detectaron utilizando el método de formación de imágenes en gel y los productos de PCR de las bandas diana se enviaron a BGI (Guangzhou) Co. Ltd. para su secuenciación. Los resultados de la secuenciación se compararon utilizando BLAST con las secuencias del NCBI GenBank. Las alineaciones de secuencia de cada gen y los genes combinados se realizaron con ClusstalX versión 1.83. El árbol filogenético de ITS y del gen de tubulina se construyó utilizando el método Neighbor-Joining con el software MEGA 7.060.

La actividad enzimática de la lacasa se midió utilizando ABTS como sustrato61, que se definió como la cantidad de enzima requerida para la oxidación catalítica de 1 μmol de sustrato ABTS a 30 °C por minuto como unidad de actividad de lacasa. La oxidación del sustrato ABTS se determinó midiendo el valor de absorción de luz de la solución de reacción a 420 nm y utilizando un coeficiente de extinción molar de 36.000 mol-1 cm-1. La actividad de la lignina peroxidasa se midió utilizando veratrol como sustrato de oxidación para producir veratrol a 30 °C62. Una unidad de actividad enzimática se definió como el cambio del valor de absorbancia de 0,1 unidades por ml de la solución de reacción por minuto. La actividad de la manganeso peroxidasa se midió mediante el método del rojo de fenol63. Una unidad de actividad enzimática se definió como el aumento del valor de absorción de luz por ml de la solución de reacción a 610 nm en 0,1 unidades, expresado como U ml-1.

La actividad celulasa se determinó utilizando un kit de detección de actividad celulasa (CL) (Beijing Solaibuo Technology Co., Ltd.) y el método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). Bajo la acción de la celulasa, la celulosa se degrada para producir un azúcar reductor y se determinó la cantidad de azúcar reductor para determinar la actividad enzimática. Del kit, se añadió 1 ml de agua ultrapura a 10 mg de estándar de glucosa anhidra (pérdida de peso seco <0,2%) para preparar una solución de glucosa de 10 mg ml-1, que luego se diluyó en 1,0, 0,8, 0,6, 0,4, 0,2, 0,1 y 0 mg mL-1 mediante dilución en gradiente. Estos se leyeron a 540 nm para establecer una curva estándar. Se pesó 1 ml de líquido de fermentación y los hongos se lisaron en un baño de hielo ultrasónico. Los sobrenadantes se centrifugaron a 4 °C durante 10 minutos a 8000 gy se colocaron en hielo 2 ml del líquido enzimático crudo en tubos de centrífuga para medirlos. El sistema de reacción estuvo compuesto por 350 μL de sustrato y 50 μL de muestra. Después de la reacción, la solución de sacarificación se obtuvo mediante ebullición para terminar la reacción. Se tomaron 50 µL de la solución de sacarificación y se agregaron y mezclaron 150 µL de reactivo DNS. Luego se agregaron 1050 μL de agua bidestilada para medir la absorbancia a 540 nm bajo el espectrofotómetro UV64,65.

El líquido de fermentación preparado se roció con semillas de T. chinensis parasitadas en Morus alba todos los días hasta los 20 días, y como control se utilizó agua y líquido sin adición de cepas de hongos endófitos. La tasa de parasitación se calculó cada 10 d hasta los 60 d, y se calculó la tasa de parasitación final. La tasa de parasitación se basó en la entrada completa del haustorio en el huésped. El líquido de fermentación es el mismo que el anterior (Preparación de enzimas líquidas).

Los resultados estadísticos se expresaron como x ± s, siendo ± el valor medio y s la desviación estándar. Se utilizó el software SPSS19.0 para realizar análisis ANOVA univariados y la prueba de homogeneidad de varianza para los datos de cada grupo. P <0,05 se consideró estadísticamente significativo.

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 81960695, 82173933, 81703649 y 81860672) y la Fundación de Ciencias Naturales de Guangxi de China (Nos. 2021GXNSFBA075037, 2018GXNSFAA281089, 2017GXNSFDA198026 y 2016GXNSFDA380012), Jardín Botánico de Plantas Medicinales de Guangxi Proyecto de formación de equipos de investigación e innovación (Nº GYCH2019008) y Proyecto de financiación de la investigación científica del Jardín Botánico de Plantas Medicinales de Guangxi (Nº GYJ202012). Los autores también agradecen al Dr. Dev Sooranna del Imperial College London por la edición en inglés del manuscrito final.

Estos autores contribuyeron igualmente: Lisha Song y Limei Pan.

Jardín Botánico de Plantas Medicinales de Guangxi, Nanning, 530023, China

Lisha Song, Limei Pan, Ni Jiang, Jine Fu, Lingyun Wan y Shugen Wei

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Manuscrito revisado y finalizado, SGW y JEF, completado la redacción del artículo, LSS y LMP, integrando y analizando los datos en las Tablas y figuras realizadas: NJ y supervisando el manuscrito completo: LYW

Correspondencia a Jine Fu, Lingyun Wan o Shugen Wei.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Song, L., Pan, L., Jiang, N. et al. Efectos de los hongos endófitos sobre el proceso parasitario de Taxillus chinensis. Representante científico 12, 7744 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11940-z

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Recibido: 16 de noviembre de 2021

Aceptado: 29 de abril de 2022

Publicado: 11 de mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11940-z

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